参景五味颗粒超高压提取工艺优化及抗疲劳作用研究Δ

韩铭鑫，张 琰，乔梦丹，戴雨霖，越 皓，郑 飞

(长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林 长春130117)

疲劳或亚健康的高发对人们生活、工作的影响日益显著，人们对其有效干预措施的需求更为急切[1-3]。目前，一般通过服用中草药来延缓或阻止疲劳的发生或加快疲劳的恢复[4]。参景五味颗粒为临床验方，由人参、五味子、西洋参及红景天等中药材组成，具有补肾填精、益气补血、滋阴清热及宁心安神等功效，服用后人体阴平阳秘，精神乃治，阴阳平衡，自能缓解疲劳，正气充足，祛病而延年，长生而久视[5-9]。本研究采用超高压技术进行提取，将其开发为颗粒制剂(批准文号目前正处于申请阶段)。近年来，超高压技术在食品杀菌、增加食品安全性及延长冷藏食品货架期等方面的应用较多，此外，其在提取植物天然活性成分方面的应用也日趋广泛[10]。叶陈丽等[11]在超高压提取与回流提取、超声提取和水煎煮法分别提取连翘中连翘酯苷A的研究中发现，超高压方法的连翘酯苷A提取率最高。超高压提取法具有操作常温、有效成分提取率高、提取时间短及能耗低等优点。本研究采用单因素及正交试验法，以人参总皂苷及五味子醇甲为考核指标，优选参景五味颗粒的最佳提取工艺参数，并通过小鼠负重游泳实验及对小鼠血清、肝脏生化指标进行测定，考察其抗疲劳功能，为今后该产品颗粒制剂的开发提供数据支持和理论基础。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1200 Series型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；DZTW型电子恒温电热套(北京市永光明医疗仪器厂)；M200 PRO型多功能酶标仪(北京世贸远东科学仪器有限公司，TECAN公司)；HPP600 MPa/30 L型超高压食品处理装置(包头科发高压科技有限责任公司)；Centrifuge 5804R型离心机(Eppendonf公司)；HH-8型数显恒温水浴锅(常州智博瑞仪器责任有限公司)；JA5 301 N型电子精密天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；KQ2200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

人参、五味子、西洋参和红景天购自吉林省仙草医药药材有限公司；人参皂苷Re标准品(批号：110754-201626，纯度为92.3%)购自中国食品药品检定研究院；五味子醇甲标准品(批号：110857-201513，纯度≥99%)购自中国食品药品检定所；Amberlite XAD-2型大孔吸附树脂(Sigma公司)；乙醇、甲醇、硫酸、冰醋酸和香草醛均为分析纯，购自北京化工厂；肝糖原试剂盒、血尿素氮试剂盒和血乳酸试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 实验动物

ICR小鼠[许可证书编号：SCXK(吉)-2011-0004]，来自吉林大学白求恩医学院实验动物中心。

2 方法与结果

2.1 超高压提取

按处方量称取药材，按比例加入一定浓度的乙醇溶剂，混匀，装入真空包装袋，排尽气泡，封口，放入超高压设备中进行提取，将压力升高至所需压力，保压一定时间后，快速卸压，得提取液，滤过，浓缩至一定体积，滤过，备用，待测。

2.2 人参总皂苷含量的测定

2.2.1 对照品溶液的制备：取人参皂苷Re对照品约20 mg，精密称定，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml含1.846 mg的溶液，即得。

2.2.2 样品处理：取浓缩至100 ml的提取液10 ml，加水定容至100 ml，吸取1.0 ml试样进行柱层析。

2.2.3 柱层析：在2 cm直径层析柱内装入3 cm高的Amberlite XAD-2大孔树脂，上加1 cm中性氧化铝。先用70%乙醇25 ml洗柱，弃去洗脱液，再用水25 ml洗柱，弃去洗脱液，精确加入已处理好的试样溶液1.0 ml，用水25 ml洗柱，以洗去糖分等水溶性杂质，弃去洗脱液，用70%乙醇25 ml洗脱人参皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，水浴挥干，以此做显色用。

2.2.4 显色：在上述已挥干的蒸发皿中准确加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2 ml，转动蒸发皿，使残渣溶解，再加高氯酸0.8 ml，混匀后移入5 ml具塞试管中，于60 ℃以下水浴加热10 min，取出，冷水冷却后，准确加入冰醋酸5.0 ml，摇匀后，以1 cm比色皿于560 nm波长处与标准管一起进行比色测定。

2.2.5 线性关系考察：吸取人参皂苷Re标准品溶液20、40、60、80及100 μl置于蒸发皿中，水浴挥干(<60 ℃)，再按“2.2.4”项下方法，与试样相同，测定吸光度。以吸光度(Y)对总皂苷含量(X)作线性回归，绘制标准曲线，得回归方程为Y=3.819 1X+0.105 2(r2=0.999 6)，总皂苷含量在0.036 9～0.184 6 mg范围内线性关系良好。

2.3 五味子醇甲含量的测定

2.3.1 对照品溶液的制备：精密称取五味子醇甲对照品5.6 mg，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，超声(功率：100 W，频率：30 kHz)10 min后摇匀，即得[12]。

2.3.2 供试品溶液的制备：精密量取浓缩至100 ml的提取液10 ml，蒸干，加适量甲醇溶解残渣，超声处理30 min(功率、频率同上)，并转移至50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.3.3 色谱条件：Agilent Eclipse Plus-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，检测波长254 nm；柱温35 ℃；进样量10 μl；流速0.4 ml/min；流动相为水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～7 min，70%～75%B；7～20 min，75%B)。

2.3.4 线性关系考察：精密吸取对照品溶液20、40、60、80及100 μl于1 ml容量瓶内，加色谱甲醇定容，配制成不同浓度的对照品溶液。按“2.3.3”项下条件进样测定并记录五味子醇甲的峰面积。以峰面积(Y)对五味子醇甲浓度(X)作线性回归，绘制标准曲线，得回归方程为Y=4 812.8X-98.886(r2=0.999 7)，五味子醇甲在2.42～11.20 μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。对照品及供试品溶液的色谱图见图1。

A.对照品溶液；B.供试品溶液A. reference solution; B. sample solution图1 五味子醇甲的高效液相色谱图Fig 1 HPLC of schisandrin

2.4 单因素试验

分别称取处方量药材，按超高压提取方法进行提取，分别考察乙醇浓度、料液比、压力及保压时间等因素对活性成分人参皂苷及五味子醇甲提取效果的影响。

2.4.1 乙醇浓度对提取效果的影响：固定料液比1∶6 g/ml，压力300 MPa，保压时间5 min，考察乙醇浓度(40%、50%、60%、70%及80%)对提取有效成分的影响[13]。结果表明，测得总皂苷的含量依次为68.40、78.06、90.46、98.00及100.72 mg/g，五味子醇甲的含量依次为1.77、2.90、3.90、3.91及3.91 mg/g；总皂苷及五味子醇甲的含量随着乙醇浓度的升高而增加，当乙醇浓度>60%时，总皂苷及五味子醇甲的含量趋于平稳。因此，选择乙醇浓度为60%～80%进行正交试验。

2.4.2 料液比对提取效果的影响：固定乙醇浓度70%，压力300 MPa，保压时间5 min，考察料液比(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10及1∶12 g/ml)对提取有效成分的影响。结果表明，测得总皂苷的含量依次为83.65、91.31、92.48、99.00及105.17 mg/g，五味子醇甲的含量依次为2.62、3.53、3.60、3.67及3.52 mg/g；料液比在1∶6～1∶12 g/ml范围内，总皂苷及五味子醇甲的含量维持稳定。考虑到溶剂成本及后续回收浓缩时能源的消耗，综合考虑选择料液比为1∶6～1∶10 g/ml进行正交试验。

2.4.3 压力对提取效果的影响：固定乙醇浓度70%，料液比1∶6 g/ml，保压时间5 min，考察压力(200、250、300、350及400 MPa)对提取有效成分的影响。结果表明，测得总皂苷的含量依次为75.32、88.64、98.51、99.36及102.13 mg/g，五味子醇甲的含量依次为2.39、3.06、3.48、3.51及3.58 mg/g；压力在200～300 MPa范围内，总皂苷及五味子醇甲的含量随压力的增加而增加；当压力升至300 MPa时，有效成分含量变化不显著，原因可能是随着压力的增加，促进有效成分的溶出，当压力达到一定值时，有效成分已充分溶出或达到饱和状态。因此，选择压力为250～350 MPa进行正交试验。

2.4.4 保压时间对提取效果的影响：固定乙醇浓度70%，料液比1∶6 g/ml，压力300 MPa，考察保压时间(1、3、5、7及9 min)对提取有效成分的影响。结果表明，测得总皂苷的含量依次为72.35、90.64、98.52、100.12及101.54 mg/g，五味子醇甲的含量依次为2.47、3.20、3.38、3.41及3.46 mg/g;保压时间在1～5 min范围内，总皂苷及五味子醇甲的含量随时间延长而增加，之后随着时间的增加，有效成分含量基本不变，体系基本达到平衡状态。因此，选择保压时间为3～5 min进行正交试验。

2.5 正交试验设计

以单因素试验为基础，采用超高压提取法，选择乙醇浓度(A)、料液比(B)、压力(C)及保压时间(D)为考察因素，采用L9(34)进行正交设计，以提取物中总皂苷和五味子醇甲的含量为考察指标。综合考虑2种成分对缓解疲劳的作用，确定五味子醇甲含量的权重系数为0.5，总皂苷含量的权重系数为0.5，以确定最佳提取工艺。因素与水平见表1，正交试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 因素与水平Tab 1 Factors and levels of orthogonal experiment

注：总皂苷含量评分=(50/总皂苷最大含量) ×含量；五味子醇甲含量评分=(50/五味子醇甲最大含量) ×含量；综合评分=总皂苷含量评分+五味子醇甲评分

Note： score of total saponin content=(50/maximum content of total saponin) × content; score of schisandrin content=(50/maximum content of schisandrin) × content; comprehensive score=score of total saponin content + score of schisandrin score

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

注：F0.05(2,2)=19，F0.01(2,2)=99

方差分析结果表明，以总皂苷含量及五味子醇甲含量为考察指标，影响有效成分提取工艺因素的作用顺序为：乙醇浓度>保压时间>提取压力>料液比，乙醇浓度、保压时间及提取压力的影响有显著性差异，结合实际生产的成本和周期，最佳工艺为A2B1C2D2，即6倍量的70%乙醇，提取压力300 MPa，保压时间5 min。

2.6 验证试验

分别取3份处方量药材，加入6倍量70%乙醇溶液，排气密封后加压至300 MPa，保压5 min，提取1次，提取液滤过，浓缩，过膜，测得人参总皂苷含量分别为124.55、126.39及127.95 mg/g，RSD为1.34%，五味子醇甲含量分别为3.68、3.65及3.55 mg/g，RSD为1.87%，与预测值较接近，提取工艺稳定可行。

2.7 参景五味提取物的抗疲劳作用研究

2.7.1 动物分组及给药：选取40只健康的雄性ICR小鼠，体质量均为(20±2) g，随机分为4组，分别为空白对照组和给药组(低剂量组、中剂量组和高剂量组)。给药组每日分别灌胃给予参景五味提取液2.70、5.40和10.80 g/kg，空白对照组每日灌胃给予等体积蒸馏水，受试样品给予小鼠时间为30 d。

2.7.2 小鼠负重游泳实验：采用约50 cm×50 cm×40 cm的游泳箱，水深30 cm，水温(25±1.0)℃，末次给予受试样品30 min后，将尾根部负荷5%体质量铅皮的小鼠置于游泳箱中游泳，记录小鼠负重游泳力竭时间[3]。结果如图2所示，与空白对照组比较，灌胃给予高、中和低剂量的参景五味提取物，均能够显著延长小鼠负重游泳的时间(P<0.05)；且随着给药剂量的增加，小鼠负重游泳的时间有所延长，表明参景五味提取物具有缓解小鼠运动性疲劳的作用。

图2 小鼠负重游泳时间Fig 2 Weight-bearing swimming time of mice

表4 参景五味提取物对小鼠生化指标的影响Tab 4 Effects of extracts of Shengjingwuwei on biochemical

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01

Note： vs. blank group,*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

研究结果表明，人参和西洋参的抗疲劳活性成分主要为人参皂苷，红景天和五味子的抗疲劳活性成分主要为红景天苷类及木脂素类化合物[15-16]。故本研究在提取工艺中以总皂苷和五味子醇甲作为考察指标，在单因素试验结果的基础上，经正交试验设计优化，确定最佳提取条件为：6倍量的70%乙醇，提取压力300 MPa，保压时间5 min。该条件下参景五味颗粒提取物中含有人参总皂苷126.30 mg/g，五味子醇甲3.63 mg/g。

疲劳是一种复杂的生理心理症状，即当机体长时间处于过度负重、紧张的环境状态时，引发的工作效率暂时降低的状态。在当今社会，因生活压力的增大而出现疲劳症状的人越来越多，年龄分布也较为广泛。当发生疲劳后，若机体无法得到及时恢复，疲劳感逐渐积累，会使机体出现内分泌紊乱、免疫功能降低等症状，严重威胁人们的身体健康[17]。血清BUN、BLA和LG是检测疲劳的最具代表性、最常用的生化指标[17-18]。当体内LG被大量消耗时，机体的活动能力会随之降低，从而引发全身性疲劳。LG贮备的提高有利于机体耐力、速度的提高，并有利于减少蛋白质和含氮化合物的分解代谢。本研究结果表明，参景五味提取物可提高小鼠的运动耐力，减少运动后体内的BUN含量和BLA堆积，增加LG的储备量，为机体提供能量，延缓疲劳产生，但其具体的抗疲劳机制及构效关系还需进一步研究。