胡芦巴总皂苷提取工艺的研究

周 彬，李清安，孙代华，张雪元，曹 菁，宋娟娟，褚飞洋

（1. 劲牌持正堂药业有限公司，湖北 黄石 435000；2. 中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北 大冶 435100）

胡芦巴为豆科植物胡芦巴的干燥成熟种子，俗称香豆子、香草子，具有温肾、祛寒、止痛作用，主要用于肾脏虚冷、小腹冷痛、小肠疝气、寒湿脚气等疾病，为药食兼用植物，国内外一些学者研究发现动物试验中胡芦巴具有降血糖的作用[1-2]，能够降低糖尿病大鼠血糖，引起了人们的关注，研究表明，胡芦巴降血糖主要功效成分有总皂苷[3-4]、多糖[5]、胡芦巴碱[6-8]、4 - 羟基异亮氨酸[9-10]等，以总皂苷为目标成分进行提取工艺研究，为胡芦巴在血糖控制方面的应用提供依据和参考。

1 试剂材料与设备

1.1 材料与试剂

胡芦巴药材，湖北正光九资河药业提供；PT 固相萃取柱，河北津杨提供；人参皂苷Re 标准品（97.4%），食品药品检定研究院提供；甲醇、冰醋酸、5%香草醛冰乙酸（香草醛5 g 加冰乙酸溶解并定容至100 mL）、高氯酸（均为分析纯），国药提供；纯净水等。

1.2 仪器

小型粉碎机，上海顶帅产品；TU1901 型紫外分光光度计，北京谱析产品；EYEL4 N-1100 型旋转蒸发仪，艾朗产品；恒温水浴锅，常州国宇产品；AB135-S 型电子天平，梅特勒产品；调速玻璃反应釜，长城科工贸产品。

2 结果与分析

2.1 样品总皂苷检测方法及标准曲线绘制

2.1.1 样品总皂苷检测方法

参照卫生部2003 版《保健食品检验与技术评价规范》中制定的总皂苷检测方法，药材粉碎过60 目筛，提取物样品粉碎过100 目筛，取1 g 药材粉末或适量提取物置于100 mL 三角瓶中，加50 mL 纯水超声提取30 min，冷却后以纯水恢复原质量，滤纸过滤，取滤液1 mL 上样已预处理的总皂苷检测专用PT 固相萃取柱（预处理方法：70%乙醇洗脱25 mL，再以纯水洗脱25 mL），先以25 mL 纯水洗脱，再以25 mL 70%乙醇洗脱，收集醇洗脱液，于蒸发皿中60 ℃蒸干，加0.4 mL 的5%香草醛冰乙酸溶解蒸发皿中的残渣、再加1.6 mL 高氯酸显色，混匀后转移至10 mL 比色管，塞上管塞，于60 ℃下水浴10 min，取出后迅速冷却并加入10 mL 的冰乙酸，充分混匀，于波长560 nm 处测定吸光度得总皂苷浓度。2.1.2 总皂苷检测标准曲线的绘制

精密称得纯度97.4%的人参皂苷Re 对照品15.67 mg 于10 mL 容量瓶，净含量为15.26 mg，甲醇溶解并定容至刻度，即质量浓度为1.526 mg/mL，分别取40，80，120，160，200，240 μL于10 mL比色管配制成质量浓度5.086 7，10.173 3，15.259 9，20.346 5， 25.433 1，30.519 7 mg/L 的人参总皂苷溶液，于60 ℃水浴蒸干，分别加入0.4 mL 的质量分数5%香草醛冰乙酸溶解残渣、再加1.6 mL 高氯酸显色，塞紧管塞，60 ℃下水浴10 min，取出后迅速冷却并加入10 mL 的冰乙酸，混匀，于波长560 nm 处测定吸光度。以总皂苷含量C 为横坐标，以吸光度A 为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程：A=0.025 94C-0.051 93，即C=（A + 0.051 93）÷0.025 94，R2=0.999 92，在5.086 7～30.519 7 mg/L 范围内线性良好。

总皂苷标准曲线见图1。

图1 总皂苷标准曲线

2.1.3 药材总皂苷检测

取胡芦巴药材适量，万能粉碎机粉碎，过筛，取过筛粉末1 g 置100 mL 容量瓶中，加100 mL 纯水超声提取30 min，再以水定容至刻度，按2.1.1 中方法检测皂苷质量分数，测得药材中总皂苷含量为1.46%，药材提取后浓缩干燥得干浸膏，得率为21.4%。

2.2 胡芦巴总皂苷正交提取

2.2.1 提取次数单因素试验

取4 份20 g 胡芦巴，设置1，2，3，4 次的提取次数梯度，以体积分数40%乙醇为提取溶剂，提取温度80 ℃，溶剂倍数10 倍，提取时间2 h，每次进行提取次数单因素试验，提取后各组不同次数提取液合并、混匀，测定体积，取适量过滤纸，滤液以2.1.1 中方法测定总皂苷含量并计算总皂苷提取率。

胡芦巴总皂苷提取次数单因素试验见表1，不同提取次数总皂苷提取率曲线见图2。

表1 胡芦巴总皂苷提取次数单因素试验

由图2 可知，胡芦巴提取3 次最佳，但2 次提取与3 次提取结果相差不大，综合时间及成本考虑，采用2 次提取。

2.2.2 提取乙醇体积分数单因素试验

分别取20 g 胡芦巴，设置0，20%，40%，60%，80%的提取乙醇体积分数梯度，以提取温度80 ℃，10 倍溶剂，提取时间2 h，提取次数2 次进行提取溶液乙醇体积分数单因素试验，提取后合并各组2 次提取液，混匀，测定体积，取适量提取液过滤纸，滤液以2.1.1 中方法测定总皂苷浓度，并计算总皂苷提取率。

胡芦巴总皂苷提取乙醇体积分数单因素试验见表2，不同乙醇体积分数下的总皂苷提取率曲线见图3。

表2 胡芦巴总皂苷提取乙醇体积分数单因素试验

由图3 可知，随着乙醇体积分数的升高，总皂苷提取率先升高再降低，40%体积分数时最佳，因此可在正交试验时设置20%，30%，40%体积分数梯度。

2.2.3 提取溶剂倍数单因素试验

图3 不同乙醇体积分数下的总皂苷提取率曲线

取5 份20 g 胡芦巴，设定8 倍，10 倍，12 倍，14 倍，16 倍的溶剂倍数梯度，以体积分数40%乙醇为提取溶剂，提取温度80 ℃，提取时间2 h ，提取次数2 次，进行不同溶剂倍数提取的单因素试验，提取后合并各组2 次提取液并混匀，测定体积，取适量提取液过滤纸，滤液以2.1.1 中方法测定总皂苷浓度并计算总皂苷提取率。

胡芦巴总皂苷提取溶剂倍数单因素试验见表3，不同溶剂倍数提取的总皂苷提取率曲线见图4。

表3 胡芦巴总皂苷提取溶剂倍数单因素试验

图4 不同溶剂倍数提取的总皂苷提取率曲线

由图4 可知，随着溶剂倍数的增加，总皂苷的提取率先升高，但达到一定倍数后，继续升高溶剂倍数，总皂苷得率反而降低，因此溶剂倍数并非越大越好，溶剂倍数过大造成提取后浓缩干燥的时间能耗成本增加及一定的总皂苷损失，根据试验结果，正交试验时可设定10 倍，12 倍，14 倍的溶剂倍数。

2.2.4 提取时间单因素试验

取5 份20 g 胡芦巴，设定1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h 的提取时间梯度，以30%乙醇为提取溶剂，提取温度80 ℃，提取次数2 次，进行不同提取时间的单因素试验，提取后合并各组的2 次提取液并混匀，测定体积，取适量提取液过滤纸，滤液以2.1.1 中方法测定总皂苷浓度并计算总皂苷提取率。

胡芦巴总皂苷提取时间单因素试验见表4，不同提取时间下的总皂苷提取率曲线见图5。

由图5 可知，随着提取时间的升高，总皂苷提取率逐步上升，在2.5 h 到达最高，3.0 h 提取2 次时提取率出现下降，正交试验时可设置2.0，2.5，3.0 h 的提取时间梯度。

表4 胡芦巴总皂苷提取时间单因素试验

图5 不同提取时间下的总皂苷提取率曲线

2.2.5 提取温度单因素试验

取5 份20 g胡芦巴，设定45，55，65，75，85 ℃的提取温度梯度，以30%乙醇为提取溶剂，12 倍溶剂，提取时间2 h，提取次数2 次，进行提取温度的单因素试验，提取后合并各组的2 次提取液并混匀，测定体积，取适量提取液过滤纸，滤液以2.1.1 方法测定总皂苷浓度并计算总皂苷提取率。

不同温度提取胡芦巴总皂苷的单因素试验见表5，不同温度提取的总皂苷提取率曲线见图6。

表5 不同温度提取胡芦巴总皂苷的单因素试验

图6 不同温度提取的总皂苷提取率曲线

由图6 可知，提取温度较低时总皂苷提取率非常低，随着提取温度的升高，总皂苷提取率在75 ℃时达到最大，因此正交试验时可设置65，75，85 ℃的提取温度梯度。

2.3 胡芦巴总皂苷的正交提取

2.3.1 正交提取

根据单因素试验结果，取9 份20 g 胡芦巴，设置葫20%，30%，40%的乙醇体积分数梯度；10 倍，12 倍，14 倍的溶剂倍数梯度；2.0，2.5，3.0 h 的提取时间梯度；65，75，85 ℃的提取温度梯度进行正交试验，考查胡芦巴总皂苷的最佳提取工艺。

胡芦巴总皂苷正交试验因素见表6，胡芦巴总皂苷正交提取试验结果见表7，胡芦巴总皂苷提取率因素效应曲线见图7。

表6 胡芦巴总皂苷正交试验因素

表7 胡芦巴总皂苷正交提取试验结果

图7 胡芦巴总皂苷提取率因素效应曲线

由正交试验结果方差分析可知，胡芦巴总皂苷提取因素影响大小依次为提取时间（C） ＞乙醇体积分数（A） ＞提取温度（D） ＞溶剂倍数（B），根据图7 的效应曲线预测胡芦巴总皂苷最佳提取工艺为A2B2C2D2，即乙醇体积分数30%，溶剂倍数12 倍，提取温度75 ℃，提取时间2.5 h，提取次数2 次。

胡芦巴总皂苷正交提取试验方差分析见表8。

表8 胡芦巴总皂苷正交提取试验方差分析

2.3.2 正交试验结果验证

分别取20 g 胡芦巴，以正交试验预测的最佳提取工艺为以体积分数30%乙醇，12 倍体积于75 ℃下提取2 次，每次2.5 h 为提取条件，设置3 组进行提取，总皂苷提取率分别为77.14%，77.55%，76.53%，均值为77.07%，总皂苷得率均值为1.13%，RSD 为0.67%（n=3），结果波动较小，且优于正交试验各组结果，说明该工艺稳定可行。

3 结论

通过试验发现，胡芦巴总皂苷提取的因素影响大小依次为提取时间（C） ＞乙醇体积分数（A） ＞提取温度（D） ＞溶剂倍数（B），根据图7 的效应曲线预测胡芦巴总皂苷提取的最佳工艺为A2B2C2D2，即乙醇体积分数30%，溶剂倍数12 倍，提取温度75 ℃，提取时间2.5 h，提取次数2 次。对该工艺进行的3 组验证提取结果显示，工艺稳定可靠，可以有效从胡芦巴中提取总皂苷，为胡芦巴的应用提供参考。