spautin-1对雨蛙素诱导的急性胰腺炎AR42J细胞凋亡及自噬的影响

张雪良 徐子琴 熊建华

自噬在急性胰腺炎(AP)发生发展中作用的研究是当前AP基础研究领域的主要热点之一。自噬是导致长寿命蛋白质或细胞器降解的主要生物学过程。自噬小体将底物与溶酶体融合形成自噬溶酶体，进而将底物进行降解[1-3]。有研究发现，大量自噬体在坏死的胰腺炎组织区域积聚[4]。杨淑丽[5]报道，3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine3-MA，3-MA)可抑制AP大鼠引发的细胞自噬，进而减轻胰腺病理损伤，其中caspase-3表达升高，Bcl-2表达下降，提示胰腺病理损伤减轻可能与3-MA诱发胰腺细胞自噬，促进腺泡细胞凋亡有关。另有研究报道，自噬抑制剂渥曼青霉素可阻止雨蛙素诱导的胰蛋白酶原激活，在一定程度上改善AP的损伤[6]。spautin-1是一个高效的自噬抑制剂，本研究应用spautin-1干预雨蛙素诱导的胰腺腺泡细胞，观察细胞凋亡及自噬的改变，为AP诊治提供实验依据。

材料与方法

一、细胞株与试剂

AR42J细胞株购自中国科学院细胞库，雨蛙素购自上海翊圣生物科技有限公司，spautin-1购自MCE公司，BGAM和乳酸脱氢酶(LDH)-细胞毒性测定试剂盒购自Sigma公司，细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司，兔抗人LC3 p62、Beclin1、β-actin抗体均购自CST公司。

二、方法

1．雨蛙素诱导AR42J细胞的AP模型建立及分组：AR42J细胞株在含有20%胎牛血清的F-12K培养基中常规培养，取对数生长期细胞，以0.8×106个/孔密度接种于96孔板，分为对照组、100 nmol/L雨蛙素处理组(雨蛙素组)、100 nmol/L雨蛙素联合10 μmol/L spautin-1处理组(雨蛙素+spautin-1组)，每组设3个复孔。雨蛙素干预AR42J细胞的剂量参考文献[7]。

2．AR42J细胞LC3、p62、Beclin1蛋白检测：分别取雨蛙素组培养0、6、12、24 h的细胞以及对照组、雨蛙素组、雨蛙素+spautin-1组培养24 h的细胞，用裂解液提取细胞总蛋白，应用ABC法定量蛋白后常规行蛋白质印迹法检测细胞LC3、p62、Beclin1蛋白表达，以β-actin为内参。兔抗人LC3抗体1∶50稀释，兔抗人p62、Beclin1抗体1∶100稀释，辣根过氧化物酶标记的IgG 1∶100稀释。最后ECL发光，X片曝光、显影、定影，用图像扫描软件测定各条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度值比表示蛋白相对表达量。

3．胰蛋白酶活性测定：采用BGAM试剂检测细胞胰蛋白酶活性。分别取上述各组细胞，应用裂解液裂解细胞，与含BGAM的胰蛋白酶反应缓冲液(10 mmol/L Tris、20 mmol/L CaCl2、pH7.4)混合后置37℃孵育30 min，上荧光仪用380 nm激发光，测定450 nm处的荧光值(A410值)。

4．AR42J细胞凋亡检测：应用细胞凋亡检测试剂盒检测。取对照组、雨蛙素组、雨蛙素+ spautin-1组培养24 h的细胞，预冷PBS洗涤两次后用250 μl的结合缓冲液重悬，调整细胞密度至1×105/ml。取1 ml细胞悬液，分别加入5 μl PE-Annexin V和7-AAD，轻轻涡旋混匀，室温避光孵育15 min，上FACScan流式细胞仪检测细胞凋亡率。

5．细胞坏死检测：取对照组、雨蛙素组、雨蛙素+spautin-1组培养24 h的培养上清，应用LDH-细胞毒性测定试剂盒测定上清液中LDH活性，严格按说明书操作。以释放到培养液中LDH的含量变化反应AR42J细胞坏死情况，根据公式计算细胞坏死率。细胞坏死率(%)=培养液的LDH活力(培养液的LDH活力-存在于活细胞内LDH活力)×100%。

三、统计学处理

结 果

一、雨蛙素诱导AR42J细胞自噬

雨蛙素组AR42J细胞的自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62表达量以及胰蛋白酶活性均随雨蛙素作用时间的延长逐渐增加，差异有统计学意义；而Beclin1表达量无显著变化(表1，图1)。

表1 雨蛙素处理AR42J细胞不同时间后自噬相关蛋白表达量及胰蛋白酶活性的变化

注：与0 h组比较，aP<0.05

图1 雨蛙素处理AR42J细胞0(1)、6(2)、12(3)、24(4)h时自噬相关蛋白表达变化

二、spautin-1抑制雨蛙素诱导的AR42J细胞自噬

对照组、雨蛙素组、雨蛙素+spautin-1组细胞LC3Ⅰ表达量分别为0.68±0.05、0.65±0.06、0.24±0.01；LC3Ⅱ为0.41±0.03、1.26±0.15、0.71±0.08；p62为0.53±0.04、1.06±0.09、0.56±0.06，雨蛙素+spautin-1组表达量较雨蛙素组显著下降，差异具有统计学意义(P值均<0.05，图2)，各组Beclin1表达量分别为0.42±0.05、0.55±0.08、0.48±0.06，差异无统计学意义。提示spautin-1可抑制雨蛙素诱导AR42J细胞的自噬。

三、spautin-1抑制雨蛙素诱导的AR42J细胞胰蛋白酶活性

对照组、雨蛙素组、雨蛙素+spautin-1组胰蛋白酶活性分别为1.01±0.05、1.65±0.18、1.13±0.14，雨蛙素+spautin-1组较雨蛙素组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。提示spautin-1可抑制雨蛙素诱导AR42J细胞自噬障碍导致的胰蛋白酶原激活。

四、spautin-1促进雨蛙素诱导的AR42J细胞凋亡

对照组、雨蛙素组、雨蛙素+spautin1组的细胞凋亡率分别为(3.42±0.53)%、(6.58±4.01)%、(23.64±2.12)%，雨蛙素组的细胞凋亡率较对照组显著增加，雨蛙素+spautin-1组又较雨蛙素组显著增加，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。提示spautin-1可促进雨蛙素诱导的AR42J细胞凋亡。

图2 对照组(1)、雨蛙素组(2)、雨蛙素+spautin-1组(3)细胞自噬相关蛋白表达

五、spautin-1抑制雨蛙素诱导的AR42J细胞坏死

对照组、雨蛙素组、雨蛙素+spautin1组的细胞坏死率分别为(1.42±0.33)%、(27.58±3.46)%、(7.64±2.12)%，雨蛙素组细胞坏死率较对照组明显增加，而雨蛙素+spautin-1组较雨蛙素组显著下降(P值均<0.05)。提示spautin-1可抑制雨蛙素诱导的AR42J细胞坏死。

讨 论

早期AP发生主要包括受损的腺泡细胞和炎症反应诱发的胰腺实质坏死等关键病理反应过程[8]。在AP早期阶段，通常在分泌后起作用的消化酶则在胰腺腺泡细胞中呈预活化状态[9]，腺泡细胞自我消化直接导致胰腺损伤。然而，目前关于消化酶特别是胰蛋白酶原激活的机制仍不清楚。此外，胰腺腺泡细胞死亡方式主要有细胞凋亡和细胞坏死，细胞凋亡被认为主要起保护性作用[10]，而坏死则可引起全身性炎症，导致远端器官损伤甚至死亡[11]。

最近研究证实，自噬阻塞引起的自噬小体聚积可能是导致酶原激活的关键因素。在乙醇与脂多糖诱导的AP模型中，由于炎症组织中的局部溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)缺失，自噬小体和溶酶体之间的融合降低[12]，导致自噬小体积聚，进而导致酶原激活。此外，抑制自噬流可导致组织蛋白酶B和组织蛋白酶C之间表达失衡，进而刺激了雨蛙素诱导的AP中胰蛋白酶原激活[13]。上述研究均证实了在AP过程中自噬流会被阻断。由此，有学者提出了AP发病机制中自噬障碍的概念[14]。自噬囊泡积聚是AP早期重要事件[15]，其中LC3Ⅱ位于自噬溶酶体内膜上，可用于指示自噬的发生。自噬流升高导致LC3Ⅱ表达增加，自噬障碍导致LC3Ⅱ和溶酶体之间的融合降低也可上调LC3Ⅱ表达水平。本研究结果发现，雨蛙素处理细胞后，自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62均随着雨蛙素作用时间延长表达逐渐增加，LC3Ⅱ表达增加表明细胞发生自噬，同时p62表达也增加，说明细胞自噬起始正常，但下游不通，吞噬体与溶酶体不能融合，表明胰腺腺泡细胞AR42J中LC3Ⅱ的水平升高主要是由于雨蛙素诱导自噬障碍导致的，同时，胰腺炎自噬受损的另一个证据是自噬流正调节因子Beclin1的变化很小。本研究中雨蛙素处理后细胞LC3Ⅰ与LC3Ⅱ表达具有类似的趋势。LC3Ⅰ在自噬障碍时被诱导表达上调[16]，因而其具有与LC3Ⅱ相似的变化趋势。此外，本研究还发现，随着雨蛙素作用时间增加，细胞中胰蛋白酶活性逐渐升高。由此可知，雨蛙素诱导AP导致自噬障碍，进而诱发胞内胰蛋白酶原激活。本研究通过spautin-1对雨蛙素诱导APAR42J细胞模型的作用发现，spautin-1可通过阻止AP细胞的自噬障碍，进而抑制胰腺细胞免受胰蛋白酶损伤、促进细胞凋亡并抑制坏死，提示spautin-1在体内可能起到缓解胰腺炎的效果。