骨桥蛋白在大鼠慢性胰腺炎中的表达及意义

王域玲 安薇 李桂香 朱建伟 蒋斐

慢性胰腺炎(CP)是一种慢性不可逆性疾病，主要病理特征为胰腺纤维化、胰管扩张扭曲，探讨胰腺纤维化相关因素有助于了解其发病机制并提供新的治疗策略[1]。骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种分泌性的酸性蛋白，与细胞外基质形成、血管增生及组织损伤修复密切相关[2-3]。研究发现OPN在纤维化的肝、肾及心脏组织中大量表达，与心肌纤维化、肾间质纤维化及肝硬化密切相关[4-6]。在肝纤维化的研究中发现，OPN可激活肝星形细胞[7]，促进其表达过多的细胞外基质如α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ, ColⅠ)，抑制OPN的表达可减轻肝纤维化[6,8]。目前尚无有关OPN与CP及胰腺纤维化的报道，本研究通过构建大鼠CP模型，探讨OPN在CP大鼠胰腺中的表达及其与胰腺纤维化的关系。

材料与方法

一、动物分组与模型建立

健康雄性Wistar大鼠，体重180～200 g，由海军军医大学动物实验中心提供，清洁级。按数字表法随机分为对照组和CP组，每组10只。采用单次尾静脉注射二氯二丁基锡(DBTC，8 mg/kg体重)构建CP模型[9-10]，以等容积无水乙醇及甘油尾静脉注射为对照组。分别在造模前及造模后1、2、4、6周测量大鼠体重，造模6周处死大鼠，观察胰腺大体形态，并取部分胰腺组织于-80℃保存，部分胰腺组织用4%多聚甲醛固定。

二、胰腺组织病理学检查

取固定胰腺组织标本，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察胰腺组织病理改变。应用Sirius Red染色评估胰腺纤维化程度，试剂盒购自Abcam公司，按说明书操作。每张切片取5个不连续低倍视野(×100)拍片，使用Image J软件计算染色面积百分比，取均值[11]。

三、胰腺组织OPN、α-SMA及ColⅠ表达检测

采用免疫组织化学法检测大鼠胰腺组织OPN、α-SMA表达。OPN、α-SMA一抗均购于Abcam公司，工作浓度分别为1∶100、1∶200。酶标二抗购于上海长岛生物试剂有限公司，应用DAB染色。每张染色切片取5个不连续高倍视野(×200)进行评分，评分包括着色强度与阳性细胞比例，着色强度以无染色、浅黄色、棕黄色、棕褐色为0～3分，阳性细胞比例以0、1%～24%、25%～49%、50%～74%、≥75%为0～4分，两评分相乘(0～12分)，取平均值为最终评分。0～2分为阴性，3～5分为弱阳性，6～8分为阳性，9～12分为强阳性。

取冷冻的胰腺组织，应用蛋白裂解液裂解，获取组织总蛋白，BCA法测定蛋白质含量(试剂盒购于碧云天公司)。取50 μg蛋白行常规蛋白质印迹法检测OPN、α-SMA及ColⅠ蛋白的表达，以GAPDH为内参。OPN、α-SMA、ColⅠ抗体及HRP标记二抗均购于Abcam公司，工作浓度分别为1∶1 000、1∶300、1∶5 000、1∶5 000，GAPDH抗体购于上海康城生物科技有限公司，工作浓度为1∶5 000。最后用ECL(Millipore公司)化学发光法显影。采用Image J软件获取条带灰度值， 以目的条带与内参条带灰度值比作为蛋白相对表达量。实验重复3次，取均值。

四、统计学处理

结 果

一、大鼠体重变化及胰腺组织病理学改变

CP组大鼠存活率为70%(7/10)，对照组大鼠存活率为100%。造模2、4、6周CP组大鼠体重均显著低于对照组[(221.89±2.51)g 比(237.36±7.80)g，P<0.05；(223.29±3.09)g比(266.05±6.26)g，P<0.01；(223.26±3.57)g比(276.93±6.82)g，P<0.01]。6周处死大鼠，肉眼见CP组胰腺组织呈暗黄色，与周围组织粘连，可见囊性病灶，未见出血、坏死。对照组无明显改变。镜下见CP组胰腺小叶间大量纤维组织增生，腺泡细胞空泡样变性坏死，小叶间大量炎症细胞浸润，胰管扩张。对照组仅有细胞水肿、脉管周围少许纤维组织(图1)。

图1 对照组(1A)及CP组(1B)胰腺组织病理改变(HE ×400)

二、 胰腺组织纤维化程度

Sirius-Red染色后CP组胰腺组织有大量鲜红色条索状及网状胶原纤维沉积于小叶间隙和腺泡间，而对照组仅在血管及胰管周围有少许纤维沉积(图2)。CP组染色面积显著大于对照组[(51±11)%比(9±4)%，差异有统计学意义(P<0.01)。

三、胰腺组织OPN、α-SMA及ColⅠ的表达

免疫组织化学结果显示，CP组OPN主要表达在腺管上皮、腺泡细胞胞质及纤维结缔组织内，对照组仅有少量表达在血管及胰管周围的纤维结缔组织内，腺泡细胞低表达(图3)。CP组7只大鼠中3只胰腺组织OPN强阳性表达，4只阳性表达；对照组10只大鼠中3只胰腺组织OPN弱阳性表达，7只阴性表达，CP组OPN的表达明显高于对照组(Z=-5.170，P<0.01)，且OPN表达与Sirius-Red染色面积呈正相关(r=0.790，P<0.01)。

图2 对照组(2A)及CP组(2B)胰腺组织胶原沉积(Sirius-Red染色 ×100)

图3 对照组(3A)及CP组(3B)胰腺组织OPN表达(免疫组织化学 ×200)

CP组大鼠胰腺组织α-SMA表达在纤维结缔组织聚集处，腺管上皮及腺泡细胞内不表达，而对照组大鼠胰腺组织α-SMA阴性表达(图4)。

图4 对照组(4A)及CP组(4B)胰腺组织α-SMA表达(免疫组织化学 ×200)

蛋白质印迹法检测结果显示，CP组OPN、α-SMA及ColⅠ的表达量均显著高于对照组(0.70±0.22比0.24±0.11，P<0.05；0.71±0.10比0.06±0.01，P<0.01；2.83±1.42比0.39±0.07，P<0.05；图5)，差异均有统计学意义。

图5 对照组(1)及CP组(2)胰腺组织OPN、α-SMA及ColⅠ蛋白表达(蛋白质印迹法)

讨 论

目前建立CP大鼠模型有多种方法，如饮食诱导、腹腔内注射雨蛙素、胰腺导管结扎、胰管内注射牛黄胆酸钠、静脉注射DBTC或内毒素以及转基因模型等方法[12]，其中单次静脉注射DBTC较为安全、简单，成模率达80%左右[10]。该模型制模后1周就可观察到胰腺实质出现炎症细胞浸润及胶原纤维沉积，其机制可能是DBTC破坏腺泡细胞及导管上皮细胞诱导胰腺发生炎性改变，坏死细胞阻塞胰管导致胰管扩张、小叶结构破坏最终造成了间质纤维化。该模型以外分泌实质破坏和纤维化为特征，后期出现内分泌实质的破坏[13]，无胰腺实质萎缩，广泛用于CP纤维化机制的研究[14-16]。本研究采用单次尾静脉注射DBTC成功建立了CP纤维化大鼠模型，除麻醉意外死去1只，注射药物24 h内死亡2只外，成活的7只大鼠均建模成功，镜下观察到小叶间大量纤维组织及炎症细胞浸润，腺泡细胞出现变性及坏死，胰管扩张；Sirius-Red染色面积显著增加；α-SMA及ColⅠ表达明显上调，提示胰腺纤维化程度较重。

OPN是一种细胞外基质细胞因子，也被称为分泌型磷酸蛋白 1，主要表达在结缔组织及纤维组织中[17]。研究显示，下调OPN可减轻甚至消除小鼠肝纤维化[8]，也可以减少扩张性心肌病中左心室的重建[18]。OPN参与纤维化的机制可能通过激活TGF-β[19]、PI3K/Akt[20]或FAK/Akt[18]等信号通路诱导纤维化的发生。Chen等[6]体外实验发现OPN通过竞争性抑制肝星形细胞的miR-129-5p在ColⅠ RNA上的结合位点，解除miR-129-5p对ColⅠ表达的抑制作用从而上调ColⅠ的表达。Rychlikova[21]等检测了CP及正常人外周血OPN水平，发现CP患者的水平显著高于对照组，特别是伴有钙化或结石的患者。本研究结果显示，CP大鼠胰腺组织OPN的表达均显著高于对照组，且其表达水平与胰腺纤维化程度呈正相关，说明OPN表达与胰腺纤维化有关。OPN如何引起胰腺发生纤维化、OPN与胰腺星形细胞活化有何联系、以OPN为靶点进行治疗对胰腺纤维化有何影响是今后需要进一步研究探讨的方向。