脂质运载蛋白-2评估急性胰腺炎继发急性肺损伤严重程度的价值
2018-08-28陈平丁燕飞忻笑容谢玲周郁芬吴云林
陈平 丁燕飞 忻笑容 谢玲 周郁芬 吴云林
脂质运载蛋白-2(lipocalin 2,Lcn-2),又称中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白或噬铁蛋白,是一种新型的分泌性蛋白,与炎症、免疫反应、细胞分化、细胞凋亡和组织重构密切相关[1]。Lcn-2作为细胞化学趋化物N-甲酰硫亮氨酰苯丙氨酸的受体之一,可诱导白细胞内颗粒释放,趋化炎症细胞聚集,消灭病原微生物。泌尿系感染、胃肠道炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘等疾病时Lcn-2呈高表达[2],但其在急性胰腺炎(AP)时的表达状况鲜见报道。本研究检侧急性坏死性胰腺炎(acute necrosis pancreatitis,ANP)大鼠Lcn-2的表达,分析Lcn-2表达与血淀粉酶、C反应蛋白(c reactive protein, CRP)水平及继发的急性肺损伤的关系,为AP发生、发展的预判及治疗靶点提供依据。
一、材料与方法
1.实验动物及分组:健康SD雄性大鼠,体重(150±30)g,由上海交通大学医学院附属瑞金医院动物实验中心提供。适应性饲养1周后进行实验。术前禁食24 h、不禁水。按随机表法将大鼠分为对照组(8只)和ANP组(24只)。采用胰胆管内逆行注射3.5%牛磺胆酸钠(1 ml/kg,Sigma公司)方法制备大鼠ANP模型。对照组注射等容积生理盐水。ANP组分别在造模后6 、24、48 h分批处死,对照组于术后48 h处死。腹主动脉取血,离心分离血清,置-80℃保存。取胰腺、肺组织分别置4%多聚甲醛溶液固定和液氮中保存。
2.检测指标:(1)血清CRP、淀粉酶水平,采用Beckman X7型全自动生化分析仪检测;(2)胰腺、肺组织常规病理检查,并参考文献[3]的方法进行病理评分;(3)取支气管肺泡灌洗液,应用细胞计数板于光学显微镜下计数中性粒细胞和巨噬细胞总数;(4)取适量新鲜肺组织称湿重,再置72℃干燥箱内烘烤24 h后称干重,计算肺湿/干重系数,即(湿重-干重)/干重×100%。
3.肺组织Lcn-2蛋白表达检测:取固定的组织,常规石蜡包埋、切片,采用S-P法行免疫组织化学染色检测Lcn-2蛋白表达。兔抗鼠Lcn-2多克隆抗体购自Cell signaling公司,工作浓度1∶100。胞质和(或)胞膜呈棕黄色为Lcn-2表达阳性。
取冷冻肺组织,应用蛋白裂解液裂解获取组织总蛋白,BCA法定量后常规行蛋白质印迹法检测Lcn-2蛋白表达,以GAPDH为内参。兔抗鼠Lcn-2多克隆抗体工作浓度1∶100,辣根过氧化物酶标记二抗购自上海康成公司,工作浓度1∶1 000。采用ECL液(Pierce公司)显影。应用Image J软件获取条带灰度值,以目的条带与内参条带灰度值比作为蛋白相对表达量。实验重复3次,取均值。
二、结果
1.血清CRP、淀粉酶水平及胰腺病理改变:ANP组大鼠胰腺组织可见间质肿胀,炎症细胞浸润,微血管壁结构破坏,红细胞渗出,腺泡细胞和脂肪细胞坏死,且随时间延长而加重。对照组大鼠胰腺组织未见明显病理学改变。ANP组各时间点血清CRP、淀粉酶水平及胰腺病理学评分均较对照组显著升高,且呈时间依赖性,差异均有统计学意义(表1)。
2.肺支气管肺泡灌洗液炎症细胞数、肺湿/干重系数及肺组织病理评分:ANP大鼠肺组织在造模后6 h可见肺泡间质充血水肿,少量炎症细胞浸润;24 h可见肺泡间质肿胀,肺泡壁破坏,炎症细胞浸润,微血管壁结构破坏,肺泡内出血;48 h可见明显的微血管壁结构破坏,肺泡内出血;对照组肺组织未见明显病理学改变。ANP组肺泡灌洗液炎症细胞数、肺湿/干重系数和肺组织病理学评分均较对照组显著升高,并呈时间依赖性,差异均有统计学意义(表2)。
表1 大鼠血清CRP、淀粉酶水平及胰腺组织病理评分在对照组和ANP组的比较
注:与对照组比较,aP<0.01;与ANP 6 h组比较,bP<0.01;与ANP 24 h组比较,cP<0.01
表2 大鼠肺泡灌洗液炎症细胞数、肺湿/干重系数及肺组织病理评分在对照组和ANP组的比较
注:与对照组比较,aP<0.01;与ANP 6 h组比较,bP<0.01;与ANP 24 h组比较,cP<0.01
3.肺组织Lcn-2蛋白表达:对照组肺泡细胞胞质内有少量棕色颗粒;ANP 6 h组胞质内有少量棕色颗粒,24、48 h组胞质内有密集的棕色颗粒(图1)。对照组及ANP 6、24、48 h组肺组织Lcn-2表达量分别为0.13±0.03、0.22±0.03、0.32±0.03、0.42±0.03,ANP组较对照组显著升高,且呈时间依赖性,差异均有统计学意义(P值均<0.01,图2)。
图1 对照组(1A)及ANP 6、24、48 h组(1B、1C、1D)肺组织Lcn-2蛋白表达(免疫组化染色 ×400)
图2 对照组(1)及ANP 6、24、48 h组(2、3、4)肺组织Lcn-2蛋白表达(蛋白质印迹法)
肺组织中的Lcn-2表达水平与肺组织损伤病理学评分、肺湿/干重系数和肺支气管肺泡灌洗液炎症细胞数均呈正相关(r值分别为0.862、0.866、0.875,P值均<0.01)。
讨论AP继发急性肺损伤的发生率可达35%,其机制可能与病程中胰酶自身消化和单核巨噬细胞活化激活中性粒细胞,释放促炎递质,并通过炎症递质级联放大,诱导肺组织内炎症细胞积聚、活化,导致急性肺损伤,故急性肺损伤的实质就是由多种炎症细胞参与的肺脏组织过度炎症反应[4]。
Lcn-2属载脂蛋白家族成员之一,在人体内分布广泛,如肾脏、支气管、胃、小肠、胰腺、前列腺及胸腺等处[5]。有研究认为,Lcn-2参与铁转运、抗菌、肿瘤浸润转移等过程;Lcn-2作为一种新型的细胞因子,参与细胞的生长分化调节及组织内蛋白水解、胶原降解过程;Lcn-2具有调节胰岛素敏感度的作用,在2型糖尿病的进展过程中扮演重要角色[6]。有研究认为,Lcn-2水平在炎症反应时表达上调,并与多种炎症递质(IL-1、IL-2、IL-8和肿瘤坏死因子α)相互作用;Lcn-2参与运输炎症反应的一些亲脂因子(血小板活化因子、白三烯B4和脂多糖等)与MMP-9结合,促进MMP-9参与炎症反应,可作为评价炎症导致的内皮损伤严重程度指标之一[7-8]。实验研究发现,小鼠肺炎时呼吸道上皮细胞通过激活Toll样受体4通路增加Lcn-2表达[9],Lcn-2又促进呼吸道上皮细胞产生IL-8,参与介导中性粒细胞趋化活动,导致肺损伤[10]。AP并发肾损伤后18、24 h,尿中Lcn-2水平明显升高,可作为急性肾损伤的早期标记物[11],推测Lcn-2可能是一种类似于CRP的新型急性时相蛋白。 本研究结果显示,ANP大鼠血清CRP、淀粉酶水平及胰腺病理评分均增加,同时肺组织损伤呈时间依赖性加重,肺组织Lcn-2蛋白表达也呈时间依赖性上调,提示Lcn-2可作为监测肺损伤严重程度的指标,为开展以Lcn-2为靶点的治疗提供理论基础。