松香酸通过诱导自噬减轻AGEs诱导的心肌H9c2细胞凋亡和内质网应激反应*

刘 芳， 刘 纪， 张 颖

(天津市环湖医院内科， 天津 300381)

晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products，AGEs)是碳水化合物与蛋白质之间发生非酶性糖基化反应形成的聚合物[1]。大量研究表明，AGEs会导致心肌细胞凋亡及内质网应激反应的增强[2-4]，而心肌细胞凋亡和内质网应激反应是糖尿病心肌病的重要环节[5-7]，AGEs在糖尿病心肌病中起着重要的作用[8]。因此，发现抑制AGEs诱导的心肌细胞凋亡及内质网应激反应的药物对糖尿病心肌病的治疗具有重要意义。松香酸(abietic acid，AA)是一种广泛存在于树木中的树脂酸，是药用植物西藏长叶松的主要生物活性物质之一[9-10]。松香酸在过敏性哮喘治疗、伤口愈合和皮肤保护方面都发挥着积极作用[11-13]。但松香酸在心肌损伤方面的作用还未见报道。本研究通过AGEs处理大鼠心肌细胞H9c2模拟心肌损伤，观察松香酸对AGEs诱导的心肌损伤、细胞凋亡及内质网应激方面的影响，并探讨松香酸影响心肌损伤的内在机制。

材 料 和 方 法

1 细胞系与主要试剂

大鼠心肌细胞系H9c2购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。AA购自Sigma;AGEs购自Calbiochem；DMEM培养基和胎牛血清购自赛默飞世尔科技公司；MTT购自上海生工；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)ELISA试剂盒购自厦门慧嘉生物科技有限公司；细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V Apoptosis Detection Kit)购自BD；抗肌红蛋白(myoglobin，Mb)、肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、cleaved caspase-12、GADD34、BiP、LC3、P62和beclin 1抗体购自Abcam。

2 方法

2.1细胞培养及细胞活力检测 H9c2细胞于含10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。用MTT法检测细胞存活率，首先将H9c2细胞制成1×107/L的细胞悬液接种于96孔板中，过夜培养后分别加入不同浓度(0、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、25、50、100、200和400 μmol/L)的松香酸培养48 h;然后向孔板中加入MTT溶液孵育4 h，弃上清后加入DMSO振荡10 min溶解结晶物;最后于570 nm处检测吸光度(A)值。后续实验分为5组：对照组加入生理盐水处理24 h；AGEs处理组加入100 mg/L AGEs处理24 h;AGEs+AA (10、25和50 μmol/L)组同时加入AGEs (100 mg/L)和AA (10、25、50 μmol/L)处理24 h。为了抑制自噬，向细胞中同时加入5 mmol/L的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)与AGEs和AA共处理24 h。

2.2Western blot检测蛋白水平 首先用PBS将待测细胞清洗3次后，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解提取总蛋白，100 ℃变性5 min。然后进行SDS-PAGE分离并转至PVDF膜，5%的BSA封闭1 h，加入相应的 I 抗，4 ℃过夜孵育，再加入辣根过氧化物酶标记的 II 抗，室温孵育1.5 h。最后加入发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照并统计灰度值计算相对表达量。

2.3ELISA检测乳酸脱氢酶含量 收集各组细胞培养物上清，按照ELISA试剂盒说明书进行检测，样品加入反应孔后37 ℃孵育45 min后用洗涤液洗涤4次，然后加入生物素标记的抗IgG抗体37 ℃反应30 min，洗涤后加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素混匀37 ℃反应30 min。最后加入显色剂避光显色15 min后加终止液终止反应，450 nm处检测A值。

2.4流式细胞术检测细胞凋亡 收集待测细胞，PBS漂洗后用1× Binding Buffer制成1×109/L的细胞悬液，300×g离心10 min，弃上清，再用1 mL 1×Binding Buffer重悬细胞，调整细胞密度至1×109/L,再用Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色15 min，室温、避光，轻轻混匀，最后利用流式细胞术对染色的细胞进行检测。

3 统计学处理

用SPSS 16.0软件对实验数据进行统计学分析，数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，运用单因素方差分析比较各组间均数的差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 松香酸对H9c2细胞活力的影响

不同浓度的松香酸处理H9c2细胞48 h后，MTT法检测细胞存活率,结果可见，低于50 μmol/L的松香酸对H9c2细胞存活率无明显影响；高于50 μmol/L的松香酸会降低H9c2细胞活力，细胞存活率低于80%，且随着松香酸浓度的增加细胞存活率逐渐降低,见图1。上述结果表明低浓度(小于50 μmol/L)的松香酸对H9c2细胞活力无明显影响，高浓度(大于50 μmol/L)的松香酸会降低H9c2细胞活力。

2 松香酸可减轻AGEs诱导的H9c2细胞损伤

Western blot结果显示，AGEs组的Mb、CK-MB和cTnI蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05);与AGEs组相比，AGEs+AA (10、25和50 μmol/L)组的Mb、CK-MB和cTnI蛋白表达水平明显降低，且松香酸浓度越高，Mb、CK-MB和cTnI的蛋白表达水平越低(P<0.05),见图2。用ELISA试剂盒检测心肌损伤标志物LDH活性,结果如图3所示,AGEs处理H9c2细胞后，LDH活性明显升高(P<0.05);

Figure 1. The effect of abietic acid (AA) on the viability of H9c2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图1松香酸对H9c2细胞活力的影响

AGEs+AA (10 μmol/L)组与AGEs组LDH活性的差异无统计学显著性，AGEs+AA (25和50 μmol/L)组的LDH活性明显低于AGEs组(P<0.05),由此可见，松香酸可减轻AGEs诱导的心肌H9c2细胞损伤。

3 松香酸可抑制AGEs诱导的H9c2细胞凋亡

流式细胞术结果显示，对照组凋亡细胞数最少，AGEs组凋亡细胞数最多，细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)；AGEs+AA (10、25和50 μmol/L)组细胞凋亡率均明显低于AGEs组(P<0.05),见图4。以上结果说明，松香酸可抑制AGEs诱导的心肌H9c2细胞凋亡。

Figure 2. Abietic acid (AA) alleviated the enhanced expression of myocardial cell damage marker proteins in the H9c2 cells induced by AGEs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAGEs group.

Figure 3. Abietic acid (AA) reduced the elevated levels of LDH in the culture supernatants of the H9c2 cells induced by AGEs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAGEs group.

4 松香酸对内质网应激相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示，AGEs组的CHOP和cleaved caspase-12蛋白水平明显高于对照组，GADD34和BiP的蛋白水平明显低于对照组(P<0.05);与AGEs组相比，AGEs+AA (10、25和50 μmol/L)组的CHOP和cleaved caspase-12蛋白水平明显降低，GADD34和BiP的蛋白水平明显升高(P<0.05)，见图5。上述结果表明，松香酸可抑制AGEs诱导的心肌H9c2细胞CHOP和cleaved caspase-12蛋白水平的上调及GADD34和BiP的下调。

5 松香酸对自噬相关蛋白表达的影响

用Western blot检测自噬相关蛋白LC3、P62和beclin 1的表达，分析松香酸对心肌H9c2细胞自噬的影响。结果显示，AGEs组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和beclin 1表达明显低于对照组，P62表达明显高于对照组(P<0.05);与AGEs组相比，AGEs+AA(10、25和50 μmol/L)组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和beclin 1表达明显升高，P62表达明显减弱(P<0.05)，见图6。由此可见，松香酸可抑制AGEs诱导的心肌细胞自噬相关蛋白表达的改变，增强心肌H9c2细胞的自噬。

Figure 4. The AGEs-induced apoptosis of H9c2 cells was inhibited by abietic acid (AA). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAGEs group.

Figure 5. The effects of abietic acid (AA) on the expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAGEs group.

Figure 6. The effects of abietic acid (AA) on the expression of autophagy-associated proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAGEs group.

6 细胞自噬抑制剂3-MA可逆转松香酸对心肌H9c2细胞的保护作用

为探索松香酸减轻AGEs诱导的心肌H9c2细胞凋亡和内质网应激的机制，用自噬抑制剂3-MA，松香酸和AGEs同时处理H9c2细胞后检测相关蛋白的表达，结果显示，AGEs+AA组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和BiP表达明显高于AGEs组；Mb和cleaved caspase-12的蛋白水平明显低于AGEs组;AGEs+3-MA组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和BiP表达明显低于AGEs组,Mb和cleaved caspase-12的蛋白水平明显高于AGEs组(P<0.05),3-MA 对心肌细胞相关蛋白的影响与松香酸相反；与AGEs+AA组相比，AGEs+AA+3-MA组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和BiP表达明显降低，Mb和cleaved caspase-12的蛋白水平明显升高(P<0.05)，见图7。上述结果表明，松香酸可通过诱导自噬减轻AGEs诱导的心肌细胞凋亡和内质网应激反应。

讨 论

许多文献报道松香酸在治疗各类疾病中具有积极作用。有研究显示松香酸可通过抑制黑色素瘤转移性和侵袭性发挥抗黑色素瘤的作用[9]。有数据显示，松香酸具有调控肝细胞葡萄糖稳态的功能，在治疗2型糖尿病和胰岛素抵抗方面有潜在的应用价值[14]。据报道，松香酸具有促进人脐静脉血管内皮细胞生成和加速皮肤伤口愈合的功效[12]。有研究表明松香酸还可减轻脂多糖诱导的肝损伤[15]。本文结果表明，松香酸可抑制AGEs诱导的心肌 H9c2细胞Mb、CK-MB和cTnI蛋白水平的升高，减弱心肌损伤。

Figure 7. The effects of abietic acid (AA; 50 μmol/L) on the expression of autophagy-, myocardial cell damage- and endoplasmic reticulum stress-related proteins (A) and apoptosis (B) were reversed by autophagy inhibitor 3-methyladenine (3-MA; 5 mmol/L). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAGEs group;&P<0.05vsAGEs+AA group.

各类疾病中常常会出现细胞凋亡的异常及各种应激反应。大量研究表明松香酸具有调控细胞凋亡及减轻各种应激反应的功效。有研究显示，松香酸可调控宫颈癌细胞凋亡[15]。有研究表明，松香酸可降低哮喘模型小鼠过敏性气道炎症[11]。本研究结果显示，AGEs处理大鼠H9c2心肌细胞会导致细胞凋亡增加，CHOP和cleaved caspase-12表达增强，GADD34和BiP表达减弱，松香酸可减低AGEs诱导的心肌细胞凋亡，抑制内质网应激相关蛋白表达的改变，减轻内质网应激反应。

自噬在糖尿病心肌病进程中发挥着重要作用[16]。Hu等[17]研究表明自噬在AGEs诱导的心肌细胞凋亡中起着重要的保护作用。有研究显示，红花提取物可抑制血管紧张素诱导的H9c2细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的降低，通过增强H9c2细胞自噬减轻细胞凋亡[18]。本文结果显示，在AGEs处理的H9c2心肌细胞中，松香酸可诱导自噬，提高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和beclin1表达，降低P62表达；自噬抑制剂3-MA可逆转松香酸对自噬相关蛋白LC3、心肌损伤相关蛋白Mb、促凋亡分子cleaved caspase-12及促存活分子BiP蛋白水平的影响。

本研究表明，在AGEs处理的心肌 H9c2细胞中，松香酸可降低心肌损伤标志物Mb、CK-MB和cTnI的蛋白水平，抑制AGEs诱导的心肌细胞凋亡率，CHOP和cleaved caspase-12蛋白水平的升高及GADD34和BiP表达的降低，上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和beclin1的表达，下调P62的表达。自噬抑制剂3-MA可逆转松香酸对心肌细胞LC3、Mb、cleaved caspase-12和BiP蛋白水平的影响。

综上所述，松香酸通过诱导自噬减轻AGEs诱导的心肌H9c2细胞凋亡和内质网应激反应。下一步计划进行松香酸影响心肌损伤的体内研究，为开发糖尿病心肌病治疗药物奠定基础。