散偏汤对偏头痛模型大鼠中脑、三叉神经节CGRP、PENK基因、蛋白表达的影响*

刘 燕 赵永烈 刘金民△

（1.北京市第一中西医结合医院，北京 100026；2.北京中医药大学东方医院，北京 100000）

偏头痛是一种发病率很高的原发性头痛，目前我国的患病率为9.3%［1］，严重危害国人健康。近年研究发现，偏头痛涉及三叉神经血管系统［2-4］。伤害性感受刺激三叉神经的初级神经元，经三叉神经脊束核传入颅内疼痛中枢 （丘脑、导水管周围灰质尾侧腹外侧区域），再传到皮质（岛回额叶皮质、前扣带回）产生头痛。在偏头痛发生过程中，三叉神经节是偏头痛发生的关键结构，中脑导水管周围灰质在疼痛信息传递和调制中起关键作用，环绕血管周围的三叉神经末梢含有的血管活性肽类物质（P物质SP、降钙素基因相关肽CGRP、神经激肽NK、内源性阿片肽等）可能是偏头痛发生的关键病理生理环节。课题组前期复制了偏头痛动物模型，对川芎等中药对偏头痛模型的镇静镇痛作用进行了初步研究，现为了进一步探索中药方剂散偏汤治疗偏头痛的生物学作用机制，进行以下研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SPF级SD大鼠24只，体质量（200±20）g，由维通利华公司实验动物中心提供。合格证号：SCXK（京）2016-0006。实验动物饲养普通级实验动物房，相对温度波动在（22±2）℃，相对湿度在30%～40%，喂养常规饲料，自由进食饮水。

1.2 试药与仪器

1）试药。散偏汤颗粒剂（组成：川芎 30 g，白芍15 g，白芷 10 g，白芥子 10 g，柴胡 10 g，制香附 10 g，郁李仁6 g，生甘草3 g。购自北京市第一中西医结合医院，江阴天江药业有限公司，检验批号：白芍1707031、香附 1706138、川芎 1701019、郁李仁 1611050、柴胡1705123、白芥子 1609007、甘草 1706018、白芷 1611077）；硝酸甘油注射液（5 mg/mL，北京益民药业有限公司生产，生产批号：H11020289。琥珀酸舒马普坦，天津华津制药有限公司，国药准字H20040700）；TRNzol总RNA提取试剂［天根生化科技（北京）有限公司DP405-02］；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa（宝生物）RR047B）；SYBRTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）， ROX plus［TaKaRa（宝生物）RR82LR］；DL2，000 DNA Marker（TaKaRa（宝生物）3427Q）引物合成（Invitrogen）；CGRP 兔多抗（Abcam ab47027）；βactin 鼠单抗（Immunoway YM3028）。 2）仪器。 Thermo Fresco21低温冷冻离心机（美国赛默飞世尔Thermo公司）；Thermo MultiSkan3酶标仪 （美国赛默飞世尔Thermo公司）；Cavoy Mini P-4电泳槽 （北京凯元信瑞仪器有限公司）；Cavoy湿转电泳槽 （北京凯元信瑞仪器有限公司）；Bio-Rad电泳仪 （美国伯乐Bio-Rad公司）；其林贝尔水平脱色摇床 （其林贝尔脱色摇床公司）；Hanna酸度计 pH211（意大利哈纳HANNA公司）；Fluka电动组织匀浆器 （美国 Fluka公司）；FlukaQL-902涡旋振荡仪 （美国 Fluka公司）；Centrifuge 5415D离心机 （德国 Eppendorf公司）；NANODROP 2000分光光度计（美国赛默飞世尔Thermo公司）；凝胶成像系统Tanon 1600（山东灏洋实验仪器设备有限公司）；ABI7500荧光定量PCR仪（美国赛默飞世尔Thermo公司）。

1.3 动物分组

24只大鼠随机分为生理盐水组、偏头痛模型组、琥珀酸舒马普坦组、散偏汤组，每组6只。

1.4 模型制备及干预方法

动物适应性喂养1周后进行造模及干预。1）生理盐水组：大鼠颈背部皮下注射2 mL/kg 0.9%氯化钠注射液，每周1次，连续3周，于第2次注射0.9%氯化钠注射液后给予10 mL/（kg·d）0.9%氯化钠注射液灌胃，普通饲养。2）偏头痛模型组：大鼠颈背部皮下注射硝酸甘油 10 mg/kg（5 mg/mL）造模，每周 1次，连续 3周，于第2次注射硝酸甘油后给予10 L/（kg·d）0.9%氯化钠注射液灌胃，共1周，普通饲养。3）琥珀酸舒马普坦组：大鼠颈背部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg（5 mg/mL）造模，每周1次，连续3周，于第2次注射硝酸甘油后给予琥珀酸舒马普坦 6 mg/（kg·d）灌胃，共 1 周，普通饲养。4）散偏汤组：大鼠颈背部皮下注射硝酸甘油溶液10 mg/kg（5 mg/mL）造模，每周 1 次，连续 3周，于第 2次注射硝酸甘油后给予散偏汤颗粒剂9.1 g/（kg·d）（分别按成人每天生药量91 g算，大鼠用药量按成人药量6倍算，大鼠每日灌胃体积为10 mL/kg，药液浓度为0.91 g/mL），散偏汤颗粒剂灌胃，共1周，普通饲养。最后1次硝酸甘油造模2 h后，给予2%戊巴比妥钠液腹腔注射麻醉（麻醉剂量：40 mg/kg），提取标本，断头取脑，在干冰保护下快速将大鼠中脑及三叉神经节剥离，放置-70℃冰箱中备用。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 一般情况观察 观察动物适应性喂养7 d内的一般情况（包括精神、活动、皮毛色泽、进食、大便等情况）。观察第3次注射硝酸甘油或0.9%氯化钠注射液后的行为变化，记录大鼠搔头次数：以前肢搔脸1次计1次，后肢快速搔头动作从开始到停止计1次，皮下注射硝酸甘油后至2 h的搔头次数，以判断实验模型复制是否成功［5］。

1.5.2 Western blotting法测定三叉神经节CGRP蛋白表达变化 准备进行SDS-PAGE，5%浓缩胶，12%分离胶，取经样品缓冲液变性处理后的待检测组织蛋白样品上样，每孔20 μg。湿转法转膜完成后经丽春红染色试剂对膜进行染色并鉴定转膜效果。将转膜良好的膜完全浸没于5%BSA-TBST中，室温轻摇封闭30 min，用5%BSA-TBST稀释一抗，稀释比例CGRP兔多抗1∶1000，室温振摇 10 min，充分混匀抗体，放 4℃摇床振摇过夜。第2日TBST洗膜5次，每次5 min，用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG（H+L）HRP，1∶10000，室温轻摇 40 min，TBST 洗膜 6 次，每次 5 min，ECL孵育，X光胶片曝光经显影，定影后，扫描ImageJ软件处理图片，TotalLab Quant读取条带IOD值。

1.5.3 Real time PCR检测大鼠中脑CGRP基因表达变化 采用TRNzol法提取组织样品总RNA，使用NanoDropTMND-2000测定RNA浓度和纯度。逆转录合成cDNA采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser进行cDNA反转录后，将96-PCR板置于Real time PCR仪上进行PCR扩增反应，CGRP上游引物CCTAGACCTGGGCACCCT，CGRP下游引物CTTCT GGGAAATGACACTGGA。按以下程序进行：95 ℃，30 s；40 个 PCR 循环［95℃，5 s；60℃，40 s（收集荧光）］。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按（95 ℃，10 s；60℃，60 s；95 ℃，15 s）；并从 60 ℃缓慢加热到99℃（仪器自动进行-Ramp Rate为0.05 ℃/s）。

1.6 统计学处理

应用SPSS22.0统计软件，首先进行正态分布和方差齐性检验，符合正态分布和方差齐性的数据，以（±s）表示，各组间进行单因素方差分析，并行LDS检验；不符合正态分布和方差不齐性，采用非参数检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况观察

见表1。适应性喂养期间各组大鼠一般情况良好，精神、毛发、食欲及大便正常。第3次注射硝酸甘油后大鼠行为学变化明显，模型组与生理盐水组搔头次数差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠2 h内行为学变化比较（次，±s）

表1 各组大鼠2 h内行为学变化比较（次，±s）

与偏头痛模型组比较，*P＜0.05。下同

组 别 n 搔头次数偏头痛模型组 6生理盐水组 6琥珀酸舒马普坦组 6 75.00±5.55 15.17±1.17*52.33±5.32*散偏汤组 657.17±1.94*

2.2 各组大鼠三叉神经节中CGRP、PENK蛋白表达比较

见表2，图1。偏头痛模型组三叉神经节CGRP蛋白表达较生理盐水组显著升高（P＜0.05）；散偏汤和琥珀酸舒马普坦干预后，CGRP含量降低，与偏头痛模型组差异有统计学意义（P＜0.05）；散偏汤和琥珀酸舒马普坦组干预后CGRP蛋白表达与生理盐水组差异无统计学意义（P＞0.05）。偏头痛模型组三叉神经节PENK蛋白表达较生理盐水组降低（P＜0.05），散偏汤组和琥珀酸舒马普坦组干预后PENK蛋白表达升高，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组三叉神经节中 CGRP、PENK表达比较（±s）

表2 各组三叉神经节中 CGRP、PENK表达比较（±s）

组 别 n CGRP PENK偏头痛模型组 6生理盐水组 6琥珀酸舒马普坦组 6 69397.00±16227.65 59133.50±19548.17 20334.00±26475.41*76597.17±15117.16*40124.60±24243.19*76507.67±10413.65*散偏汤组 640144.67±22944.31*76402.00±4921.75*

图1 各组大鼠三叉神经节中CGRP、PENK蛋白表达

2.3 各组大鼠中脑CGRP、PENK基因表达比较 见表3。偏头痛模型组大鼠中脑CGRP基因表达较生理盐水组升高（P＜0.05）；散偏汤和琥珀酸舒马普坦干预后，CGRP基因表达减少，与偏头痛模型组差异有统计学意义（P＜0.05），与生理盐水组差异无统计学意义（P＞0.05），散偏汤与琥珀酸舒马普坦组差异无统计学意义（P＞0.05）；偏头痛模型组中脑PENK蛋白表达较生理盐水组降低，差异无统计学意义（P＞0.05），散偏汤组和琥珀酸舒马普坦组中脑PENK基因表达与模型组比较升高，差异无统计学意义（P＞0.05），与生理盐水组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠中脑CGRP、PENK表达比较（±s）

表3 各组大鼠中脑CGRP、PENK表达比较（±s）

组 别 n CGRP PENK偏头痛模型组 6生理盐水组 6琥珀酸舒马普坦组 6 2.80±2.38 0.77±0.19 0.93±0.29* 0.83±0.17 0.66±1.98* 0.87±0.21散偏汤组 60.66±0.21* 0.91±0.19

3 讨 论

散偏汤记载于清·陈士铎《辨证录·卷二》，主治半边头风。陈士铎认为“此病得之郁气不宣，又加风邪袭之于少阳之经”。故应用散偏汤祛风疏肝，通络止痛，方药白芍、川芎、郁李仁、柴胡、白芥子、香附、甘草、白芷组成。散偏汤中川芎为君药，辛香善升，祛风止痛作用，为治头痛要药；白芷祛风解表，燥湿通窍，消痰，助川芎散头风；白芥子通窍蠲痰，引药入深，直达病所；柴胡、香附升清举阳、疏肝达郁。现代医家常用散偏汤治疗偏头痛，其临床疗效显著［6］，但其作用机制尚不完全明确。

CGRP是一种神经肽，广泛存在于中枢和周围神经系统的感觉神经元胞体和末梢，通过外周炎症和中枢调节来提高偏头痛患者的神经传递［7-8］。CGRP在外周由背根神经节合成，在中枢由三叉神经节合成，偏头痛发作时，血管周围神经末梢和三叉神经节释放CGRP到颈内外静脉，外周血中CGRP浓度升高，CGRP作用于血管平滑肌引起血管扩张，外周血管扩张引起硬脑膜肥大细胞脱颗粒，释放许多神经活性及血管活性物质，如TNF-α、5-HT、组胺、缓激肽等引起神经源性炎症，这些致炎因子又可刺激CGRP的持续释放。CGRP同时通过轴突反射将外周组织的局部感觉传到中枢，CGRP在偏头痛的发病过程除了发挥疼痛递质外还通过AMPA（AMPA）型谷氨酸受体导致疼痛致敏，放大痛觉信号。总之，在偏头痛的发病过程中，CGRP在多个阶段发挥广泛且重要的作用，是偏头痛发生的分子生物学特征之一，为CGRP受体拮抗剂治疗偏头痛的理论基础［8］。也是偏头痛研究领域不可忽视的重要理论之一。

内啡肽（EOPS）是在体内发挥吗啡样效应的神经肽，是神经肽中与疼痛关系比较密切的一类物质，在脑内和脊髓中有明显的镇痛作用，脑啡肽（ENK）是内啡肽的一种，PENK是ENK系统的前体（包括甲硫氨酸-脑啡肽、亮氨酸-脑啡肽、甲七肽和甲八肽等）。内啡肽系统在外周主要是通过抑制神经元兴奋，延缓痛觉信号的扩散和传递，发挥镇痛作用；在中枢主要是影响中脑导水管周围灰质、延髓腹内侧核等内源性痛觉调制系统内的脊髓投射神经元的活化，激活痛觉下行抑制系统，发挥镇痛作用，研究内啡肽系统在脑内的镇痛作用在偏头痛治疗的研究中有着重要意义。

我国文献在殷商甲骨文就有“疾首”的交记载，《内经》称本病为“脑风”“首风”。中医学认为脑为清阳之府，易受风邪，风邪上扰，津液气血运行失常，津聚成痰，气血瘀滞，痰瘀阻窍，脑失清灵不通则痛。散偏汤作为中药治疗偏头痛，组方治法治则对偏头痛发病的病因病机有针对性，且无药物依赖、成瘾及药物过量性头痛出现的危险，同时现代药理学研究发现散偏汤中的川芎、白芷、白芍、白芥子、香附均有不同程度的镇静镇痛作用［10-15］。在本实验研究中观察到散偏汤组大鼠在注射硝酸甘油后烦躁、搔头的表现较偏头痛模型组明显减少，以安静蜷卧为主，其后间断活动，说明散偏汤能够改善偏头痛动物模型的行为学症状，有一定的镇静镇痛作用。研究中观察到中脑及三叉神经节CGRP基因及蛋白表达下降，三叉神经节中PENK蛋白表达升高，并且有统计学意义，实验大鼠中脑中PENK表达下降，但经散偏汤和琥珀酸舒马普坦干预后较偏头痛模型组有所升高，考虑散偏汤能够减少CGRP在中脑和三叉神经节的表达，提高镇痛物质PENK在中脑和三叉神经节的表达。本实验中散偏汤和舒马普坦能够改善硝酸甘油造成偏头痛大鼠的病理状态，能够抑制CGRP介导疼痛信号的传导，改善内啡肽系统中枢镇痛作用，对散偏汤治疗偏头痛提供了客观的物质基础，可能为散偏汤镇静镇痛的机制之一。课题组将进一步研究散偏汤在偏头痛作用的靶点和机制，为临床治疗提供依据。