冬连三七组分改善糖尿病动脉粥样硬化兔心肌病理的机理研究

靳昭辉，靳冰*，高普，宋光熠，刘征堂，相田园

(1.中国中医科学院西苑医院，北京 100091;2.辽宁省基础医学研究所，辽宁 沈阳 110005)

随着人们生活水平的日益提高，糖尿病的发病率越来越高。糖尿病动脉粥样硬化(diabetic atherosclerosis，DA)是糖尿病重要的远期并发症和死亡原因。

由于高血糖和脂代谢紊乱，导致DA大兔心脏重量(主要是左心室重量)和体重比值(即心系数)的差异，这间接反映了心室壁病理性肥厚的程度。糖尿病动脉硬化的心肌损伤与糖基化终末产物(AGEs)、局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)激活等相关；既往研究表明AGEs可能参与了心肌RAS的激活[1]。RAS系统被激活后致血管收缩，刺激心肌纤维组织增生，促进血管平滑肌增生，增加血管阻力，致使血管收缩-舒张失衡，从而引发DA心肌损伤。持续高血糖环境会导致机体产生大量氧自由基(ROS)[2-3]，ROS可以通过AGEs[4]引起Na+-K+-ATPase酶活性降低，诱发心肌损伤。抑制非酶糖基化过程，减少AGEs的形成，抑制RAS系统，升高Na+-K+-ATPase酶活性可以减少2型糖尿病动脉粥样硬化心肌损伤的发生发展。

我们在前期4项国家自然科学基金课题研究中发现[5-16]：冬连三七组分(麦冬多糖40%、黄连生物碱30%、三七总皂甙30%，CONR)能够调整DA大兔糖脂代谢紊乱，减轻其炎症反应及氧化应激反应，并减少AGEs含量。

在既往研究结果CONR能抑制AGEs产生基础上，本实验研究了CONR减轻RASS系统激活,提高Na+-K+-ATPase酶活性从而改善DA兔的心肌损伤，并探讨其机理。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性纯种新西兰大白兔(辽宁长生，SCXK(辽)2010-0001),体质量(2.5±0.3)kg。实验前适应性喂养1周,湿度70%±5%，温度(22±2)℃，自由饮食，单笼喂养。

1.2 药物

辛伐他汀(杭州默沙东制药有限公司,140213);CONR(北京同仁堂药业公司);四氧嘧啶(BDH Limited Poole England,5272460J)。

1.3 试剂与仪器

1.3.1 主要试剂

蛋白抽提试剂、Millipore 2 mg/mL、羊抗IgG、HPR；10×Tris-Glycine-SDS、5×还原样品缓冲液、10×TBST pH 8.0、湿转缓冲液(赛诺博)；Bis-Acrylamide、Tween-20、TEMED、BCA蛋白定量试剂盒(Pierce)；Stripping Buffer、PMSF、Acrylamide、APS Ponceau S、DTT、Bromphenol Blue、丽春红染色液(AMRESCO)；α-actinin、NP-40、Trizma base、Glycine、BSA标准品、免疫组织化学试剂盒(Sigma)；磷酸酶抑制剂(Roche)；二甲苯和乙醇、PBS缓冲液、蛋白酶K工作液(中国医科大学基础研究所)。

1.3.2 主要仪器

倒置相差显微镜;超低温冰箱;37℃温箱;CO2培养箱;优普超纯水机;酶标分析仪;全自动生化分析仪、湿盒；激光共聚焦扫描显微镜;微量加样器。低温离心机(Thermo)，凝胶成像系统;酶标仪;MiniP-4、紫外/可见分光光度计;电泳仪(伯乐生命);湿转电泳槽(Cavoy)；酸度计pH211(Hanna);半干槽、电动组织匀浆仪(上海琪特)、水平脱色摇床。

1.4 实验方法

1.4.1 DA大兔模型制备

随机取10只雄性新西兰大白兔作为正常组进行对照,其余50只兔用于制备模型并进行实验，耳缘静脉推注5%四氧嘧啶(100 mg/kg)[17-18],6 h和12 h腹腔注射10%葡萄糖10 mL/只用于预防胰腺突然破坏造成的严重低血糖,72 h后测空腹血糖,选取空腹血糖在16.7～23.5 mmol/L兔。模型兔喂高脂饲料(含2%胆固醇、0.5%胆酸和5%猪油)30 g/(kg·d);1周后行腹主动脉内膜球囊损伤术[17，19],术后实验各组继续喂养高脂饲料，并分别每日给予CONR450 mg/kg、150 mg/kg、50 mg/kg;辛伐他汀3 mg/kg灌胃10周，正常组喂食普通饲料30 g/(kg d),4餐/日。

1.4.2 心脏重量、左心室重量，计算心体比、左心室/体重指数测定

于最后1次灌药后处死大兔；称量各组大兔体质量,迅速取出心脏,分别除去薄膜称重,记录心脏重量、左心室重量，计算心体比、左心室/体质量指数;留取心肌组织备用。

1.4.3 心肌组织AngⅡ、Na+-K+-ATPase含量测定

取心肌组织匀浆,离心,用放免法测定AngⅡ、Na+-K+-ATPase含量。

1.4.4 免疫组化法测定ACE在心肌组织的表达

染色步骤按免疫组织化学试剂盒说明书进行，经DAB显色，观察阳性细胞，用PBS代替一抗作为阴性对照。每张切片随机选取10个视野，在光密度和放大倍数一致的条件下，光镜下统计得到阳性染色面积占选定分析总面积的比值，取其均值。

1.4.5 HE染色行心肌病理

将固定好的标本乙醇脱水，石蜡包埋，制成4 μm石蜡切片，行HE染色，光镜下拍片并观察心肌病理变化。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 模型建立情况

分别选取并处死2只模型兔, 1只正常兔，取腹主动脉。观察主动脉病变分布情况:模型组腹主动脉内膜有许多黄白色或橙红色条纹凸起,甚至大部分被斑块覆盖，正常组无病变。

2.2 CONR对DA兔心脏重量、左心室重量、心体比、左心室/体质量指数的影响

结果示:与正常组比较,模型兔左心室重量(LCW)、心脏重量(CW)、左心室 /体质量指数(LC/W)、心体比(C/W)增加(P<0.05)。CONR大、中剂量组能降低DA大兔LCW、CW、C/W、LC/W。 详见图1，图2。

图1 CONR对DA兔CW、LCW的影响注：与正常组比较,*P<0.05；与模型组比较,△△P<0.01，△P<0.05

图2 CONR对DA兔C/W、LC/W的影响注：与正常组比较,*P<0.05；与模型组比较,△△P<0.01，△P<0.05

2.3 CONR对DA兔肌组织 AngⅡ、Na+-K+-ATPase表达的影响

模型兔心肌组织AngⅡ含量明显升高(P<0.01),心肌Na+-K+-ATPase活性明显下降(P<0.01)。治疗组各组均能减少DA大兔心肌AngⅡ含量(P<0.01),提高DA大兔心肌Na+-K+-ATPase活性(P<0.01)。详见图3。

图3 CONR对DA兔AngⅡ、Na+-K+-ATPase的影响注：与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,△△P<0.01，△P<0.05

2.4 CONR对DA大兔心肌ACE的影响

DA模型兔心肌ACE受体呈现高表达状态(P<0.01)。CONR能显著抑制DA大兔心肌ACE受体表达(P<0.01或P<0.05)。详见图4,图5。

图4 CONR对DA兔ACE的影响注：与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,△△P<0.01，△P<0.05

图5 对DA兔心肌组织ACE的影响免疫组化图

2.5 CONR对DA大兔主动脉病理的影响

模型组心肌细胞肿胀变性，水肿明显，细胞质内有大量的空泡形成，心肌间质纤维结构紊乱。CONR高、中剂量组及辛伐他汀组心肌细胞水肿、炎性细胞浸润、心肌间质纤维排列紊乱增生等病理改变得到改善。详见图6。

图6 各组大兔心肌标本HE染色(400×)标尺：20 μm

3 讨论

高糖环境加速AGEs形成，AGEs与RAGE结合在心肌组织中形成交联结构，使各种酶敏感性下降、动脉硬化，从而心肌收缩/舒张功能异常。既往研究[5]结果显示：CONR能抑制体内糖基化过程，减少糖基化终产物的生成从而减少2型糖尿病心肌缺血。

AGEs[1]可以激活局部RAS系统导致糖尿病大鼠冠状动脉结构和功能改变。本实验DA大兔心肌AngⅡ含量明显升高，ACE受体表达明显升高，表明DA心脏局部RAS的激活。心肌局部AngⅡ增高，可以引起血管收缩和平滑肌细胞增殖，刺激心肌成纤维细胞增生，胶原代谢紊乱，加速心肌损害，影响心脏舒缩功能[20]。

本实验研究结果显示：治疗组各组均能明显抑制AngII含量，抑制ACE受体的表达，延缓糖尿病大兔心肌肥厚的进程，改善心脏收缩和舒张功能，从而达到治疗DA兔心肌损伤的目的。

Na+-K+-ATP酶可使ATP发生水解，保持细胞内高钾和细胞外高钠，对维持细胞内外离子梯度，膜兴奋性及细胞新陈代谢等生物功能的变化具有重要作用。高血糖条件下，机体产生的大量ROS可以通过AGEs引起Na+-K+-ATPase酶活性降低，诱发心肌损伤，导致糖尿病动脉粥样硬化的产生与发展。

中医理论认为消渴病及其并发症的主要病机是阴虚燥热兼有血瘀。我们结合现代药理研究，以滋阴清热、活血祛瘀为治则创立了冬连三七组分。在前期4项国自然研究中,应用先进技术使麦冬多糖，三七总皂甙及黄连生物碱的提纯含量达到90%以上,麦冬多糖40%,黄连生物碱30%,三七总皂甙30%是经过反复测验得到的最佳配比方案。

本次研究结果显示，CONR可显著降低DA大兔左心室重量、心脏重量、左心室/体质量指数、心体比，提高DA兔心肌Na+-K+-ATPase活性，减少心肌组织AngⅡ含量,并抑制心肌ACE受体表达；CONR明显改善了DA兔心肌细胞水肿、炎性细胞浸润、心肌间质纤维排列紊乱增生等病理改变。

综上，CONR可能通过抑制AGEs产生，减轻RASS系统激活,提高Na+-K+-ATPase酶活性从而改善DA兔的心肌损伤。