ELISA检测猪尿中β-受体激动剂类药物影响因素研究

李延山,刘庆伟，卞大伟，徐国荣，李洪根，王小柱，刘映雪，张志遥，田 颖

(1.辽宁省畜产品安全监察所，辽宁沈阳 110003；2.辽宁省黑山县畜牧兽医局，辽宁黑山 121400)

β-受体激动剂(俗称“瘦肉精”)对畜产品安全和人类健康造成了极大威胁和影响，一直是人们关注的焦点。经过多年的治理，非法使用“瘦肉精”行为得到有效遏制。但受利益驱使，少数不法生产经营者违法使用“瘦肉精”问题始终难以根除，特别是生猪养殖、运输和屠宰等环节“瘦肉精”都有不同程度地检出[1-2]。加强生猪养殖、运输和屠宰等环节“瘦肉精”的监管，把住基层监管的第一道关口，是有效遏制“瘦肉精”非法使用的关键一环。完善基层检测手段是准确及时完成工作任务的有力保障。在我们多年来的“瘦肉精”监督检测工作中发现，采用ELISA检测β-受体激动剂类药物中盐酸克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的过程中，经常出现不同程度的阳性率，有的经过质谱方法确证后结果为阴性[3-4]。这种ELISA检测结果的不确定性一直困扰着基层监督检测人员，既耗时、耗力，又造成大量的浪费，给基层监督工作带来极大的不便，严重影响工作效率，为摸清干扰因素，完善基层“瘦肉精”监督检测手段，提高工作效率。我们针对生猪饲养中常用药物及添加剂检测进行了干扰因素研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 替米考星预混剂(100 g/kg)、复方磺胺氯哒嗪钠粉、氟苯尼考粉(100 g/kg)、蛋氨酸铬、ZnSO4·H2O，大连三仪动物药品有限公司提供。

1.1.2 试验用动物 健康生长育肥猪，体重为50 kg～60 kg。

1.1.3 试剂盒 克伦特罗酶联免疫试剂盒、莱克多巴胺酶联免疫试剂盒、沙丁胺醇酶联免疫试剂盒,北京维德维康生物技术有限公司产品。

1.2 方法

选择体重为50 kg～60 kg的生长育肥猪33头，随机分为6组。复方磺胺氯哒嗪钠(下称H)组6头、氟苯尼考粉(下称F)组6头、替米考星预混剂(下称T)组5头、蛋氨酸铬(下称C)组5头、ZnSO4·H2O(下称Z)组6头，空白(下称B)组5头。分别对应饲喂含有复方磺胺氯哒嗪钠粉(每天1次，饲喂浓度0.2 g/kg)，氟苯尼考粉(100 g/kg)(每天2次，饲喂浓度0.3 g/kg)，替米考星预混剂(100 g/kg)(每天1次，饲料中4 g/kg)，蛋氨酸铬(每天3次，按Cr元素计算饲料中150 mg/kg)，ZnSO4·H2O(每天3次，按Zn元素计算饲料150 mg/kg)，空白对照(每天3次)的饲料，并于连续饲喂3 d后的1、6、12、24 h时间点进行猪尿液采集，并将采集的尿液置于4℃冷藏备检。

2 结果

结果见表1～表3。克伦特罗最低检测限为0.5 μg/mL。检测结果表明，替米考星预混剂(100 g/kg)、复方磺胺氯哒嗪钠粉、氟苯尼考粉(100 g/kg)和蛋氨酸铬、ZnSO4·H2O对ELISA检测猪尿中克伦特罗无阳性结果出现(表1)。

莱克多巴胺最低检测限为0.5 μg/mL。检测结果表明，替米考星预混剂(100 g/kg)、复方磺胺氯哒嗪钠粉、氟苯尼考粉(100 g/kg)和蛋氨酸铬、ZnSO4·H2O对ELISA检测猪尿中莱克多巴胺无阳性结果出现(表2)。

沙丁胺醇最低检测限为0.5 μg/mL。H组采集猪尿样24份，假阳性结果7份，分别分布于6 h尿样1份，12 h尿样4份，24 h尿样2份，假阳性率29.17%；F组采集猪尿样24份，假阳性结果2份，全部分布于12 h后，假阳性率8.3%；T组采集猪尿样20份，假阳性结果2份，全部分布于12 h后，假阳性率10%(图1)。上述结果表明，替米考星预混剂(100 g/kg)、复方磺胺氯哒嗪钠粉、氟苯尼考粉(100 g/kg)对ELISA检测猪尿中沙丁胺醇均有假阳性结果出现。饲料添加剂蛋氨酸铬、ZnSO4·H2O对ELISA检测沙丁胺醇无假阳性结果出现。

表1 药物、饲料添加剂对猪尿中克伦特罗ELISA检测结果的影响

表2 药物、饲料添加剂对猪尿中莱克多巴胺ELISA检测结果的影响

综上所述，替米考星预混剂(100 g/kg)、复方磺胺氯哒嗪钠粉、氟苯尼考粉(100 g/kg)对ELISA检测猪尿中克伦特罗、莱克多巴胺无假阳性影响，对检测沙丁胺醇有不同程度的假阳性影响。其影响程度为复方磺胺氯哒嗪钠粉(29.17%)>替米考星预混剂(10.0%)>氟苯尼考粉(8.3%)。饲料添加剂蛋氨酸铬、ZnSO4·H2O对ELISA检测猪尿中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇均无假阳性影响。

3 讨论

沙丁胺醇为苯乙醇胺类β-受体激动剂，分子母核中有2个呈弱酸性的酚羟基(-OH)，可与磺胺氯哒嗪钠中的-NH2发生反应。从而使包被的沙丁胺醇消耗量增大，洗涤后残留的抗原抗体复合物减少，进而使结果假阳性率增多。这与本试验结果基本一致[5-6]。氟苯尼考和替米考星药物也呈现假阳性，这与曹玉美等[7]的研究结果基本一致。尿液成分和药物代谢过程较为复杂，具体原因仍需探究。

表3 药物、饲料添加剂对猪尿中沙丁胺醇ELISA检测结果的影响

克伦特罗、莱克多巴胺组未检测到假阳性尿样。说明上述3种兽药在本试验中对ELISA检测克伦特罗、莱克多巴胺未造成干扰。究其原因，可能与本试验未筛选到可能造成干扰的药物或不同阶段动物代谢变化等原因，有待今后进一步研究。

杨照海[8]认为，饲料中金属离子含量太高会影响抗原抗体的结合，硫酸锌会干扰尿样的盐酸克伦特罗检测，但在本试验中未见相同结果。现有文献报道中对离子影响产生假阳性的报道较少，需进一步确证。

通过上述分析，一方面目前用于“瘦肉精”残留快速检测的ELISA 准确性受环境、人员、工艺、畜种等多种因素制约，产生假阳性的原因也不尽相同[9-12]。本试验中选用的5种常用兽药及饲料添加剂具有一定代表性但并不全面，会有一些干扰因素并未发现或找到。另一方面，在基层监督检验工作中，检验人员应不断强化自身素质，尽量减少实验误差，提高结果的准确性。此外，在抽样检测前还应询问查证用药记录，尽可能避免在上述3种容易引起假阳性药物的休药期内进行检测。检测过程中一旦出现疑似阳性，必须通过液相色谱-质谱法等确证方法进行确证，保证检测结果的科学性与严谨性，从而为畜产品安全保驾护航[13-17]。

图1 ELISA检测猪尿沙丁胺醇假阳性率比较