低聚半乳糖对小鼠肠道菌群的调节作用

刘广芹，涂玉蓉，江耀伦，李美娣，易永萍，陈素珍，温 馨，武 力

(华南农业大学兽医学院/广州华农大实验兽药有限公司，广东广州 510642)

功能性低聚糖作为无残留、化学性质稳定、无毒无害无副作用的绿色添加剂，对动物机体肠道菌群调节作用效果显著。研究发现功能性低聚糖能够促进肠道有益菌的增殖，抑制有害菌的生长[1-3]。目前已研究发现的功能性低聚糖有20多种，主要有低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖等[4]。低聚半乳糖是已被开发的唯一源自动物乳汁的低聚糖[5],其安全度高，食疗效果明显，对人体健康有益，已获得广泛认可。本研究主要分析低聚半乳糖在体内外对小鼠肠道菌群的调节作用，为低聚半乳糖在临床上的推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 大肠埃希菌O78(CVCC1569)、嗜酸乳杆菌，广州华农大实验兽药有限公司研发中心保存菌种。

1.1.2 实验动物 Balb/c雄性小鼠50 只，6周龄～8 周龄，体重18 g～22 g，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号SCXK(粤)2013—0002。

1.1.3 试剂 70%低聚半乳糖粉，云浮市新金山生物科技有限公司产品；MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基、LB肉汤培养基、营养琼脂培养基TSC培养基、D-环丝氨酸、革兰染色液，广东环凯微生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 体外试验 用20、30、40 g/L的低聚半乳糖处理培养基，含葡萄糖培养基为对照组。根据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[6]对大肠埃希菌和乳酸杆菌进行稀释和培养，观察不同添加量低聚半乳糖对大肠埃希菌和乳酸杆菌生长的影响。

分别取含有20、30、40 g/L的低聚半乳糖的LB肉汤培养基200 μL于96孔板内，然后接种稀释10-7倍大肠埃希菌菌液100 μL，每组3个平行，置36℃±1℃温箱内培养24 h，每隔3 h测定630 nm的吸光度，连续测定24 h并绘制生长曲线。相同方法，将乳酸杆菌稀释10-8倍，厌氧培养测定乳酸杆菌630 nm的吸光度。

1.2.2 体内试验 参考《保健食品检验与评价技术规范2003》[7]中调节肠道菌群功能检测方法，试验分别设人体推荐剂量的5、10、30倍作为试验剂量，设立对照组。具体处理见表1。

称取各组小鼠体重取平均值，并分别将含量为70%的低聚半乳糖根据上表中的剂量进行相应受试物的配制，受试药物用无菌蒸馏水配制，灭菌，分装，不同剂量组试样4℃冷藏保存。在第0、7、14天无菌压迫法定量采集小鼠新鲜粪便，处理后进行菌群培养和鉴定，对大肠埃希菌、产气荚膜梭菌和乳酸杆菌进行计数，计数菌落在30～300之间的平板，计算出每克粪便中的活菌数(CFU/g)，换算成以10为底的对数进行统计分析。

试验数据以平均数±标准差表示，采用SPSS 20.0软件中单因素方差分析(One-Way ANVOA)进行统计，P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著，均值采用Duncan法进行多重比较。

表1 低聚半乳糖体外试验分组及处理

注：每组每日清晨一次经口灌胃0.2 mL ，连续灌胃14 d。对照组灌胃无菌蒸馏水。

Note: Each group was orally administered 0.2 mL once daily in the morning and continued for 14 days.The control group was given sterile distilled water.

2 结果

2.1 低聚半乳糖对大肠埃希菌和乳酸杆菌的影响

按照20、30、40 g/L剂量添加低聚半乳糖，大肠埃希菌菌落数分别为3.70×108、1.96×108、2.4×108CFU/mL，乳酸杆菌菌落数分别为4.73×109、4.20×109、3.80×109CFU/mL。其中30 g/L组和40 g/L组大肠埃希菌菌落数与对照组3.2×108CFU/mL相比差异显著 (P<0.05)，乳酸菌各组与对照组3.27×109CFU/mL相比落数均有不同程度的增长(P<0.05)，由此可以看出，体外添加一定浓度的低聚半乳糖对大肠埃希菌增殖具有一定的抑制作用，当添加量为30 g/L时效果最明显；体外添加一定浓度低聚半乳糖对均能促进乳酸菌生长(图1和图2)。

2.2 低聚半乳糖对大肠埃希菌和乳酸杆菌OD值的影响

由图3可知，大肠埃希菌可以利用低聚半乳糖，转接后的6 h内大肠埃希菌的生长比较缓慢，在6 h～9 h内大肠埃希菌生长速度，在16 h开始菌体浓度趋于稳定，此时30 g/L浓度的低聚半乳糖组大肠埃希菌的浓度最低。由图4可知，乳酸杆菌可以利用低聚半乳糖，转接后的15 h内乳酸菌的生长比较缓慢，在15 h～30 h内乳酸菌生长速度，在36 h开始菌体浓度趋于稳定，此时30 g/L半乳糖组乳酸杆菌浓度最高。

图1 低聚半乳糖对大肠埃希菌体外增殖效果

图2 低聚半乳糖对乳酸杆菌体外增殖效果

2.3 低聚半乳糖对小鼠粪便中大肠埃希菌、产气荚膜梭菌和乳酸杆菌的作用

用低聚半乳糖对小鼠进行14 d灌胃饲养，结果显示，灌胃第7天与灌胃前比较，低、中、高剂量组大肠埃希菌数量均明显减少(P<0.05)，灌胃第7天低聚半乳糖低、中、高剂量组大肠埃希菌数量分别为5.22、5.25、5.52 log CFU/g,表明低聚半乳糖可抑制小鼠体内大肠埃希菌的增殖，本试验中灌胃第7天低聚半乳糖各剂量组对大肠埃希菌增殖有不同程度抑制作用，其中低聚半乳糖中低剂量组对大肠埃希菌的抑制效果最明显(图5)。

用低聚半乳糖灌胃小鼠第7天和第14天，低、中、高剂量组产气荚膜梭菌数量比对照组明显减少(P<0.05)。灌胃第7天低聚半乳糖低、中、高剂量组产气荚膜梭菌数量分别为4.85、5.13、5.08 logCFU/g；灌胃第14天低聚半乳糖低、中、高剂量组产气荚膜梭菌数量分别为4.80、5.05、5.09 logCFU/g；从灌胃7天和14天的数据得出灌胃7 d～14 d内,小鼠粪便产气荚膜梭菌数量保持相对稳定(图6)。

灌胃第7天时低聚半乳糖低剂量组和高剂量组乳酸杆菌数量显著增加(P<0.05)，灌胃第14天低、中剂量组乳酸杆菌数量增加，但低剂量组灌胃14天乳酸菌数量比灌胃第7天减少，高剂量组灌胃14 d与灌胃第0、7天比较乳酸杆菌减少，均具有显著差异(P<0.05)。灌胃第7天低聚半乳糖低、中、高剂量组乳酸杆菌数量分别为8.82、8.34、8.62 logCFU/g；由此可知，低聚半乳糖在一定的浓度范围内能够促进乳酸杆菌的增殖(图7)。

图3 大肠埃希菌的生长曲线

图4 乳酸菌的生长曲线

图5 低聚半乳糖对小鼠肠道大肠埃希菌的影响

图6 低聚半乳糖对小鼠肠道产气荚膜梭菌的影响

图7 低聚半乳糖对小鼠肠道乳酸杆菌的影响

3 讨论

动物机体健康的肠道菌群环境参与动物的生长、发育、代谢、营养吸收、免疫等过程，为机体健康构建一道防御屏障[8]。肠道疾病的发生受饲料、水源、环境卫生、温度、湿度、动物自身免疫力等多种因素影响。肠道中繁杂的微生物在机体健康状态下互相依存、互相制约构建菌群平衡，其中最主要的有益菌乳酸杆菌对肠道健康起到重要调节作用。De Angelis M等[9]发现，仔猪饲喂乳酸菌肠道内大肠埃希菌数量下降，腹泻得到改善，因此提高动物肠道有益菌数量，减少有害菌是保证肠道健康的重要途径。Roberfroid M等[10]研究发现，低聚糖能够增加乳酸菌的数量，减少有害菌，该研究结果与本研究低聚半乳糖对小鼠肠道菌调节作用结果相一致。

本研究中在体外试验下低聚半乳糖在30 g/L浓度下显著抑制了大肠埃希菌的生长，促进了乳酸杆菌的生长。在小鼠肠道体内试验中，低聚半乳糖在灌胃第7天明显抑制了大肠埃希菌和产气荚膜梭菌的增殖，有效促进了乳酸杆菌的增殖，与本研究体外实验结果以及Blaut M等[11]、Alliet P等[12]对功能性低聚糖能够抑制有害菌促进有益菌生长的研究结果一致。

本研究低聚半乳糖在体外可以抑制大肠埃希菌的生长，促进乳酸杆菌生长，结合低聚半乳糖体外对大肠埃希菌的抑制和对乳酸杆菌的促进作用，以及临床应用的成本得出最佳浓度为30 g/L。

体内试验中低聚半乳糖在小鼠肠道内促进乳酸杆菌的增殖，抑制大肠埃希菌和产气荚膜梭菌的增殖。体内试验中低聚半乳糖和低聚果糖对大肠埃希菌、产气荚膜梭菌和乳酸杆菌的作用受低聚糖的剂量和灌胃时间影响，本研究中灌胃第7天低剂量组低聚半乳糖对肠道菌群调节作用最佳，灌胃14 d时大肠埃希菌和乳酸杆菌增减不一。根据《保健食品检验与评价技术规范2003》中肠道菌群测定中的判定标准，灌胃7 d小鼠粪便中乳杆菌的数量增加，产气荚膜梭菌的数量减少且大肠埃希菌的数量减少，表明低聚半乳糖具有调节肠道菌群作用。