陕北白绒山羊小反刍兽疫疫苗免疫后抗体水平检测

郝玉青,高 娴,王利荣,刘健鹏, 白崇生,孙岩,白艳艳*

(1.榆林市动物疫病预防控制中心,陕西榆林 719000;2.榆林市动物卫生监督所，陕西榆林 719000)

小反刍兽疫(Peste des petis ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petis ruminants virus,PPRV)引起的一种山羊、绵羊等小反刍兽类的急性接触传染性病，发病率和病死率均较高[1]。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。2014年4月3日榆林市定边县盐场堡镇贾圈村发生一起疑似小反刍兽疫疫情，4月5日该疫情得到国家外来动物疫病预防控制中心确诊[2]，标志着小反刍兽疫已传入榆林市。该病尚无有效治疗方法，主要通过早期诊断和疫苗免疫接种进行防控[3]。小反刍兽疫作为外来新病种在免疫接种相关知识上存在较大空白，缺乏理论依据，凭经验进行大面积接种推广疫苗存在一定风险，该疫苗使用的实际效果成为了全市业内人员及养羊户最为关心的问题之一。本研究对在榆林地区陕北白绒山羊免疫接种小反刍兽疫疫苗的安全性、首免时间、免疫效果和免疫抗体持续期进行研究,初步确定了PPR的免疫效果及安全性，为本地区大面积的免疫接种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 榆阳区马合镇陕北白绒山羊种羊场基础繁殖母羊，试验羊只临床检查健康、无临床疾病表现。试验羊按规范进行饲养和管理，精饲料为配合饲料，粗饲料为青干草，为舍饲饲养。试验羊只未接种过小反刍兽疫疫苗，基础抗体为阴性。

1.1.2 疫苗 小反刍兽疫弱毒疫苗，新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生产，每头份疫苗含有的小反刍兽疫弱毒病毒不低于103TCID50，免疫持续期暂定为36个月。

1.1.3 诊断试剂盒 小反刍兽疫间接ELISA试剂盒(批号：2014061802)，购自中国农业科学院兰州兽医研究所；小反刍兽疫金标检测试剂卡(批号：2014061802)，购自北京信诺生物有限公司；小反刍兽疫阻断ELISA试剂盒购(批号201606、201701、201706)，购自青岛立见生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫羊临床安全性观察 榆林地区PPR春季防疫免疫后，对全市免疫羊群进行疫苗安全性问卷调查或走访；对试验组羊临床观察，制定免疫后饲养临床观察日志，观察接种后15 d内羊只有无过敏反应、局部不适、全身不良反应等现象，并记录接种后5个月内出生羔羊的发育、成活率等情况。

1.2.2 不同免疫方法的抗体检测 选取成熟且配耳标的未免疫母羊60只，随机分A、B、C、D 4个圈饲养，A圈20只羊颈部皮下注射1倍剂量PPR疫苗，B圈20只羊颈部肌肉注射1倍剂量PPR疫苗，C圈16只羊颈部皮下注射2倍剂量PPR疫苗，D圈4只对照组羊未免疫。免疫前、免疫后7 d、14 d颈静脉采血分离血清用于抗体水平测定。

1.2.3 免疫抗体持续期检测 选取基础抗体为零的33只5月龄同群羊，其中试验组28只免疫过小反刍兽疫弱毒苗，对照组5只羊不免疫，分别在第0、2、15、28、41、54、67周采血抗体检测，颈静脉采集全血，分离的血清按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128稀释后进行抗体效价检测，试验操作按阻断ELISA试剂盒说明书进行。

1.2.4 母源抗体的检测 母羊免疫抗体阳性，6个月后陆续生产，观察其生产性能、羔羊生长发育和成活率。选取生产相差1 d～2 d的母羊单独饲养在一起，羔羊22只，于30、44、58、72、88日龄采血，应用阻断ELISA试剂盒测定其母源抗体水平。

1.2.5 不同检测方法的比较 使用市面上出售的间接ELISA、阻断ELISA、抗体检测金标试纸卡按操作说明书进行，比较分析不同方法的检测结果，选出适合本单位使用的抗体检测方法。

2 结果2.1 免疫羊临床安全性观察

免疫母羊在免疫后15 d内未发现任何局部或全身不良反应，母羊生产的羔羊也未发现弱羔、发育不全、成活率低等状况，证明PPR疫苗临床应用较安全。

2.2 不同免疫方法的抗体检测

60只发育成熟且配有耳标的母羊，小反刍兽疫基础抗体为阴性，分别在免疫前(0 d)、免疫后7 d、14 d测免疫抗体，结果见表1。

表1 不同剂量或不同免疫方法的免疫检测结果

对照组4只羊在未免疫后7 d、14 d后体内PPRV抗体全部阴性，排除试验组自然感染的可能。试验组疫苗免疫后7 d有抗体产生，PB平均值67.93±17.25，14 d后抗体阳性率达到100%，PB平均值83.83±10.03，说明免疫接种14 d后产生的免疫抗体水平较高；皮下1倍剂量注射、肌肉注射，14 d后都能产生较高水平的免疫抗体，说明皮下、肌肉注射都比较安全，且都能产生高水平的抗体；皮下1倍剂量注射、2倍剂量注射后，结果经SPSS软件进行卡方检验，免疫抗体水平的差异不显著(P>0.05)，1倍剂量免疫后效果较好，无需加大剂量，说明1倍剂量中含有的病毒量足以刺激机体产生合格免疫抗体。

2.3 免疫抗体持续期检测

对基础抗体为阴性的33只5月龄同群羊分别在第0、2、15、28、41、54、67周采血，分离血清检测抗体水平,利用每组抗体滴度的几何平均数来表示每个时间点的平均抗体滴度，制作PPRV免疫抗体消长折线图(图1)。

对照组5只羊(耳标号0821、0813、0815、0817、0820)，免疫组28只羊中有1只淘汰(耳标号4196)，实际检测32只羊的免疫抗体，对照组羊抗体始终为阴性，试验组羊免疫2周后抗体水平达到峰值，免疫抗体合格率达到100%；第15、28、41、54、67周，免疫组抗体滴度的离散度较大，平均抗体滴度随时间推移持续下降，但抗体合格率到免疫后67周一直保持在100%。

图1 PPRV免疫抗体消长情况

2.4 母源抗体的检测

对22只羔羊分别在30、44、58、72、88日龄进行母源抗体检测，结果见表2。

表2 母源抗体检测结果

试验结果表明，羔羊在58日龄以内母源抗体水平较高，羔羊能获得较好的保护，避免PPRV的早期感染，随着日龄的增加羔羊母源抗体水平下降，尤其在72日龄左右抗体水平下降比较显著，因此可以在羔羊72 d左右时进行免疫接种。羔羊88日龄时，母源抗体已趋于消失，选择在90 d～100 d羔羊断奶[4]时再免疫，担心存在羔羊抵挡不了外界PPRV的侵染，因此首免具体时间应根据羔羊母源抗体水平来决定。

2.5 不同检测方法的比较

随机选取免疫后的63份羊血清分别用阻断ELISA、间接ELISA及抗体检测金标卡的方法测定抗体效价，结果见表3。间接ELISA检出的阳性率最高，阻断ELISA此之，胶体金卡检出的阳性率最低。

表3 不同检测方法比较结果

3 讨论

对榆林地区的各县区养殖场及养殖户进行小反刍兽疫疫苗临床应用调查结果表明，未发现任何不良反应，母羊繁殖性能未受影响，对疫情危险区接种疫苗后，疫情得到了有效控制，未见免疫接种后的羊群再次发生该病，安全性试验结果与印春生等[5]和杨鲜银[6]报道的一致，表明该疫苗对陕北白绒山羊安全性良好。按照说明书剂量皮下1倍剂量、2倍剂量或肌肉注射接种后，结果用SPSS软件进行卡方检验，免疫抗体水平的差异不显著(P>0.05)，说明含有的病毒量足以刺激机体产生合格免疫抗体，非特殊情况下不必加大使用剂量。免疫后7 d已经开始产生抗体，14 d后抗体合格率上升为100%，抗体水平达到峰值，这与徐雅萍[7]报道的一致，表明该疫苗具有很好的免疫效果。

繁殖母羊群已进行过PPR疫苗接种，抗体阳性，出生的羔羊母源抗体在72日龄内维持在较高水平，羔羊能获得较好的保护，避免PPRV的早期感染，随着日龄的增加，羔羊母源抗体水平降低，88日龄抗体下降趋势最为显著。在实际生产中，羔羊的首次免疫应根据母源抗体消长来确定，一方面这种母源抗体除有抗PPRV感染、起到被动免疫作用外，在一定条件下会不同程度地干扰弱毒苗接种和抑制主动免疫抗体的产生；另一方面，免疫过晚易造成免疫空挡。考虑到目前母羊免疫工作确实到位，根据本研究中羔羊母源抗体消长规律，羔羊72日龄左右时进行免疫接种，既减少了母源抗体的影响，又避免了免疫空档期[8-9]。榆林市作为PPR免疫地区，每年春、秋两季对未免疫的新生羔羊进行补免，而本地的产羔高峰期在当年12月至次年2月，春季防疫一般在3月开始，散养户可以在春季防疫时免疫新生羔羊，规模场首免具体时间应根据监测羔羊母源抗体水平决定。

抗体检测是了解免疫效果不可缺少的手段，而检测方法的不同往往导致结果存在一定的差异，在本研究中，应用阻断ELISA、间接ELISA和胶体金卡3种方法对羊血清进行小反刍兽疫免疫抗体检测，结果显示，3种检测方法的抗体阳性率有显著差异，胶体金抗体阳性率较低，间接ELISA抗体阳性率较高。分析主要原因可能是胶体金抗原成分与被检抗体的亲和性，也与检测的合格率直接相关，因此小反刍兽疫抗体胶体金只能作为早期诊断基础和适时免疫参考，不能应用到规模场免疫抗体水平检测中，仅适合基层养殖场免疫抗体粗略评估。ELISA检测技术较成熟，具有很高的特异性和敏感性[10]，适用于反刍动物免疫抗体水平考核评估。应用阻断ELISA对基础抗体为阴性的陕北白绒山羊进行免疫抗体持续期检测，结合试验结果，表明新疆天康畜牧生物技术有限公司生产的小反刍兽疫弱毒疫苗的免疫抗体维持期至少可以达到67周。