宁夏牛隐孢子虫感染情况调查研究

杨佳冰，周海宁，米荣升，张烨华，沙湧波，周永利，李志红，李 莉，陈兆国*，王进香*

(1.宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心，宁夏银川 750011；2.中国农业科学院上海兽医研究所/农业部动物产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室(上海) 农业部动物寄生虫学重点实验室，上海200241；3.宁夏平罗县动物疫病预防控制中心，宁夏平罗 753400)

牛隐孢子虫病是由隐孢子虫(Cryptosporidium)寄生于牛胃肠道或呼吸道黏膜上皮细胞内，引起牛的以严重腹泻为主要特征的一种人兽共患的寄生性原虫病[1]。牛感染隐孢子虫主要表现为精神沉郁、厌食、腹泻，粪便呈奶油状，灰白色或黄褐色，有大量纤维素、血液和黏液，后呈透明水样粪便，严重的引发死亡，给养牛业造成巨大的经济损失[2]。

1971年，Panciera R等[3]报道全球首例牛感染隐孢子虫(美国)，随后世界范围内都有报道。关于我国牛隐孢子虫的感染情况，周圣文等于1985年首次在黑龙江省奶牛中发现隐孢子虫感染[4]，随后我国多个省份都有报道，感染率在0.09%～82.00%[4-6]。对于宁夏牛隐孢子虫的感染情况，已有学者对部分地区做了调查研究。检测方法主要有漂浮和染色后的显微镜检，以及PCR检测，其感染率在1.68%～61.7%之间[7-10]。但是，这些报道只关注了宁夏部分地区的感染情况，而且多数是关于奶牛的调查研究[8]，目前尚不了解宁夏牛整体的感染情况，包括地域特征、年龄分布、品系差异等。本次调查选取了宁夏全部5个地级市，涵盖10个县(区)的奶牛和肉牛规模养殖场，采集粪便样品，采用牛隐孢子虫粪便抗原检测试剂盒，对全区的牛隐孢子虫感染情况进行了调查，为进一步摸清全区牛隐孢子虫的感染情况，制定全区牛隐孢子虫的防控措施提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂盒 牛隐孢子虫抗原检测试剂盒(CryptosporidiumAg Test Kit)，货号EBENT4-1001，美国Kernel公司产品。

1.1.2 粪便样本的采集 2017年2月～4月，分别从宁夏10个县(区)的10个规模养殖场采集奶牛和肉牛粪便样品600份，其中奶牛样品240份，肉牛样品360份。待检样品分别来自4个奶牛养殖场(银川市兴庆区、中卫市海原县、石嘴山市惠农区和平罗县)和6个肉牛养殖场(银川市贺兰县、吴忠市利通区和同心县、固原市原州区和泾源县、中卫市沙坡头区)。所有养殖场按照断奶前、育成牛、成年牛3个年龄段进行采样，每个年龄段采集样品200份。样品置于冰盒中保存，带回实验室，1周内处理完。

1.2 方法

1.2.1 ELISA检测 参照牛隐孢子虫抗原检测试剂盒说明书进行。将0.5 g粪便样品与4.5 mL洗涤工作液混合，充分混匀，离心后取上清液备用。每孔加入70 μL上清液，同时设阳性对照和阴性对照孔，分别加试剂盒提供的阴性和阳性溶液70 μL。样品加好以后，将酶标板置于25℃恒温培养箱中，孵育30 min。随后用洗涤液洗板5次，每孔加入70 μL隐孢子虫酶标物，25℃孵育30 min。重复洗板5次，每孔加入100 μL底物，混匀，避光，25℃孵育10 min。观察记录结果。所有样品重复3次。

1.2.2 判定标准 阴性对照应该为无色或者浅蓝色。阳性对照为深蓝色。如果样品蓝色比阴性对照颜色深，该样品为隐孢子虫病原阳性，反之，样品为阴性。

1.2.3 数据统计和分析 利用Microsoft Excel 2013和SPSS 21.0软件对获得的数据进行整理和统计分析，采用卡方检验(χ2)方法，比较不同地区、不同日龄、不同品种牛的隐孢子虫阳性率差异是否显著。当P<0.05时，判定为差异显著；当P<0.01时，判定为差异极显著。

2 结果

2.1 不同地区牛隐孢子虫感染情况

本次调查涵盖了全区5个地级市的10个县(区)的样品，其中包括4个奶牛养殖场和6个肉牛养殖场，每个场采集样品60份。结果显示，牛隐孢子虫总阳性率为26.17%(157/600)，其中奶牛阳性率为10.42%(25/240)，肉牛的阳性率为36.67%(132/300)，二者差异极显著(P<0.01)(表1、表2和图1)。4个地区奶牛阳性率分别为23.33%(石嘴山市惠农区)、15.00%(石嘴山市平罗县)、1.67%(银川市兴庆区)和1.67%(中卫市海原县)，4个场之间阳性率差异极显著(P<0.01)(表1)。6个地区肉牛的阳性率分别为63.33%(固原市泾源县)、55.00%(银川市贺兰县)、48.33%(吴忠市同心县)、20.00%(中卫市沙坡头区)、18.33%(固原市原州区)和16.67%(吴忠市利通区)，不同地区之间阳性率差异极显著(P<0.01)(表2)。

表1 不同地区奶牛场隐孢子虫感染情况

注：同一列中相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note:In the same column,same letters mean no significant difference (P>0.05),different small letters mean significant difference (P<0.05),and different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

表2 不同地区肉牛场隐孢子虫感染情况

注：同一列中相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note:In the same column,same letters mean no significant difference (P>0.05),different small letters mean significant difference (P<0.05),and different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

2.2 不同年龄阶段牛隐孢子感染情况

本次调查，每个牛场分3个年龄阶段取样，分别是断奶前、育成牛和成年牛。结果显示，奶牛样品中育成牛和成年牛的阳性率均为11.25%(9/80)，高于断奶前犊牛(8.75%，7/80)，不同年龄阶段之间阳性率差异不显著(P>0.05)(表3)；肉牛则随着年龄的增长，隐孢子虫阳性率逐渐增高，其中成年牛最高，为41.67%(50/120)，其次是育成牛35.00%(42/120)，断奶前犊牛阳性率最低，为33.33%(40/120)，不同年龄阶段之间阳性率差异不显著(P>0.05)(表4)。统计分析表明，肉牛无论是在断奶前(P<0.01)、育成阶段(P<0.01)，还是成年阶段(P<0.01)，隐孢子虫的阳性率均极显著高于奶牛(P<0.01)(图2)。

图1 奶牛和肉牛隐孢子虫感染情况

年龄阶段 Age stage样品数Sample number阳性数Positive number阳性率/% Positive rate断奶前 Pre-weaned8078.75a育成牛 Post-weaned80911.25a成年牛 Adult80911.25a合计 Total2402510.42

注：同一列中相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

Note:In the same column,same letters mean no significant difference (P>0.05).

表4 不同年龄阶段肉牛隐孢子虫的感染情况

注：同一列中相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

Note:In the same column,same letters mean no significant difference (P>0.05).

图2 不同年龄阶段牛隐孢子虫感染情况

3 讨论

当前，隐孢子虫是仅次于轮状病毒的第二大致腹泻病原，对人群的危害十分严重，并且给畜禽养殖业造成巨大的经济损失。宁夏畜牧业历史悠久，是全国十大牧区之一。2015年末，全区牛饲养量达到250万头，其中肉牛存栏98.0万头，奶牛存栏40万头，牛出栏106万头，但是宁夏牛隐孢子虫的感染情况的调查研究还非常少，而且多数是小范围的调查。本研究选取了整个宁夏5个地级市的部分规模养殖场，应用牛隐孢子虫抗原ELISA检测试剂盒，对10个县(区)的奶牛和肉牛养殖场进行随机取样600份，检出157份阳性样品，总阳性率为26.17%。本次调查共检测4个奶牛场，240份样品，总的阳性率为10.42%，该结果低于之前用漂浮法和染色法对银川和固原地区奶牛场进行调查结果(50.9%，69/136；31.2%，148/475)[7-8]；高于利用PCR对宁夏奶牛的检测结果(1.68%，23/1 366；5.45%，92/1 688)[9-10]。对于肉牛的检测，本次调查选取了6个养殖场，采集样品360份，总阳性率为36.67%，该结果高于杨建民等[8]对银川和固原地区肉牛的检测结果(16.8%，69/408)。上述结果的差异，可能与检测方法的不同和采样季节的不同有关。

统计分析表明，宁夏地区肉牛隐孢子虫感染的阳性率显著高于奶牛的阳性率，这与我国很多地区的调查结果都不相同。如对黑龙江和陕西的调查发现，奶牛的阳性率要略高于肉牛的，但二者差异并不显著[11-12]；对青海省西宁地区的调查发现，肉牛的阳性率略高于奶牛，二者的差异并不显著[13]；而对湖南和吉林延边的调查发现，奶牛的阳性率显著高于肉牛[14-15]。造成这些结果的差异，可能与采用的检测方法不同，采样的地区不同有关。

对于不同年龄牛隐孢子虫感染情况调查发现，在肉牛中成年牛感染率最高，其次是育成牛，断奶前犊牛阳性率最低；在奶牛中，成年牛与育成牛阳性率相同，均高于犊牛，而且各个年龄阶段肉牛的阳性率均显著高于奶牛。关于奶牛隐孢子虫的调查，本次调查获得的结果与鲍嘉铭等[7]对银川地区奶牛的调查结果不同，该调查发现成年牛的阳性率(60.29%，41/68)要高于育成牛(44.1%，15/34)和犊牛(38.2%，13/34)；同样，与Huang J等[9]和Zhang X X等[10]对宁夏部分地区奶牛样品的分子检测结果也不相同，分子检测结果显示，断奶前犊牛隐孢子虫阳性率最高，随着年龄的增长，隐孢子虫的阳性率逐渐下降。造成这些结果的偏差可能与检测方法、采样季节不同有关。

据报道，牛感染的虫种主要有4种，分别为微小隐孢子虫(C.parvum)、牛隐孢子虫(C.bovis)、瑞氏隐孢子虫(C.ryanae)和安氏隐孢子虫(C.andersoni)，并且牛感染的隐孢子虫虫种与年龄相关，其中C.parvum主要感染断奶前犊牛，C.bovis和C.ryanae主要感染断奶后犊牛，C.andersoni主要感染成年牛[16]，其中C.parvum是感染人的主要虫种。本试验采用的是隐孢子虫粪抗原ELISA检测方法，并不能够鉴定牛感染的虫种，因此，下一步需对阳性样品进行分子检测，以评估其对人的潜在威胁。

目前国内对隐孢子虫的检测，主要是显微镜镜检法和分子检测，这两种方法均耗时，需要有一定的工作基础才可以操作。本研究采用的直接检测粪抗原的ELISA方法，国内尚属首次，该方法不仅操作简单、省时，而且非常适合田间样品的初筛。有研究表明，粪便抗原ELISA检测的敏感性要低于染色法和分子检测方法，但是具有很好的特异性[17-19]。对宁夏地区的研究和以前的研究报道相比，该方法检出的阳性率要低于显微镜镜检法，但是高于分子检测方法，这可能与采样的区域，采样的季节相关，下一步有待对这批样品分别进行显微镜镜检和分子检测，验证该方法的敏感性和特异性。

综上所述，本研究在国内首次应用牛隐孢子虫粪便抗原检测试剂盒，对宁夏全区奶牛和肉牛进行了检测。检测结果表明，本地区奶牛和肉牛均存在隐孢子虫感染，且各个年龄段均易感。不同地区阳性率不同，肉牛的感染情况显著高于奶牛。本次调查的结果对于制定和完善宁夏地区牛隐孢子虫的防控方案，减少隐孢子虫病对牛的危害，降低人畜感染的机率，提供有力的数据支撑。