液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中7种氟喹诺酮类药物的残留量

张 晶，王桂琴

(宁夏大学农学院，宁夏银川 750021)

氟喹诺酮类药物属于第3代喹诺酮类抗菌药，它是将氟原子引入喹诺酮萘啶环的6位处，哌嗪环连在7位上，因此又被统称为氟喹诺酮类[1]。氟喹诺酮类药物是一种人工合成的抗菌药物，通过对DNA回旋酶进行抑制，从而导致染色体的不可逆损害[2]。由于质粒传导耐药性并不会对氟喹诺酮类药物产生影响，因此它与许多抗菌药物之间没有交叉耐药性；同时因其有抗菌谱广、抗菌力强、组织穿透力强、不良反应少等特点，而在人类及动物感染性疾病的预防和治疗中被广泛地应用[3-5]。特别是在兽医临床方面，恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星和诺氟沙星已经成为水产养殖专用的抗菌药物。由于在动物体内氟喹诺酮类药物的残留消除缓慢，过量的药物残留被人体摄入后，会损害人体健康[6]。因此，对此类药物的残留检测，各国都制定了相关的检测法规。氟喹诺酮类药物在临床上常被用作抗菌类药物，少量使用时，对动物的生长具有一定的促进作用，但如果过量使用会造成药物在动物性食品中残留，不仅会发生过敏反应，可能还会伴随其他不良反应[7]。同时使用该药物过量时，可能还会导致中枢神经系统、消化系统和肝肾等器官的病变，因此氟喹诺酮类药物必须严格控制用量，以确保家禽及其产品安全[8-9]。

建立一种快速、灵敏、准确的方法，检测动物性食品中氟喹诺酮类药物的残留量，以此对食品中氟喹诺酮类药物的含量进行监控，具有重要的现实意义。目前，国内外对氟喹诺酮类药物常用检测技术的研究报道较多[10-13]，其中已有较多的文献对液相色谱-串联质谱法进行了报道[14-18]，其在食品质量安全检测中的作用也越来越重要。本试验采用高效液相色谱-串联质谱法，同时检测鸡蛋中7种氟喹诺酮类药物的残留量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 环丙沙星，购自中国食品药品研究所；洛美沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星、诺氟沙星和恶喹酸，购自中国兽医药品监察所。柠檬酸(分析纯)、磷酸氢二钠(分析纯)、甲醇、乙腈、甲醇-乙腈溶液(体积比为40∶60)、甲酸(99%)、氢氧化钠(分析纯)、乙二胺四乙酸二钠(分析纯)，科密欧试剂公司产品。

1.1.2 仪器 高效液相色谱-串联质谱仪(Waters ACQUITY UPLC/TQ-S micro)，美国Waters公司产品；高速冷冻离心机CR22G，日本日立公司产品；旋涡混匀器MS3，IKA公司产品；电子天平AX-205、电子天平PL202-L、酸度计GB/T11165，梅特勒-托利多仪器有限公司产品；振荡器WSZ-100-A，上海安亭公司产品；组织匀浆机，JKA公司产品；氮吹仪N-EVAP112，美国Organomation Associates JnC公司产品。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠71.63 g，用水溶解后，用容量瓶定容至1 000mL；0.1 mol/L柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.01 g，用水溶解后，用容量瓶定容至1 000 mL；Mcllvaine缓冲溶液：把1 000 mL 0.1 mol/L的柠檬酸溶液和625 mL 0.2 mol/L的磷酸氢二钠溶液混合，用盐酸或氢氧化钠调节pH为4.0±0.05；0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：称取60.5 g乙二胺四乙酸二钠，然后将其加入1 625 mL的Mcllvaine缓冲溶液中，振荡摇匀，使其充分溶解；50 mL/L甲醇水溶液;2 mL/L甲酸水溶液。

1.2.2 储备液的配制 分别将各标准品精确称取0.010 0 g，放置于10.0 mL棕色容量瓶中，用甲醇使其溶解，并定容至刻度。标准储备液的浓度为1 mg/mL，置-20℃冰箱中保存，3个月内使用。

1.2.3 标准工作液的配制 将1.2.2配制的各标准储备液稀释，配成混合标准溶液。各组分的浓度为10 μg/mL。将此标准工作液置于4℃保存，3个月内使用。

1.2.4 样品前处理

1.2.4.1 提取 将均质试样准确称取5.00 g，置于50 mL离心管中，然后加入Mcllvaine EDTA- Na2缓冲溶液液10 mL，涡旋混匀1 min，振荡10 min，于-4℃、10 000 r/min离心5 min后，将上清液提取转移至另一50 mL的离心管中，在上清液中加10 mL的水饱和正己烷，涡旋混匀，振荡10 min后，于-4℃、10 000 r/min离心5 min，将下层备用液用吸管转移至另一50 mL的离心管中，然后再加入10 mL水饱和正己烷，涡旋混匀，振荡10 min，于-4℃、10 000 r/min离心5 min，弃去上层正己烷，下层备用液过柱。

1.2.4.2 净化 用6 mL甲醇洗涤HLB固相萃取柱(200 mg,6 mL)，并用6 mL的水进行活化。然后将1.2.4.1提取的备用液过柱，过柱的速度最好为2 mL/min～3 mL/min，将滤液弃去，用2 mL 50 mL/L的甲醇水溶液进行淋洗，同样将淋洗液弃去，并把小柱抽干，再用6 mL的甲醇进行洗脱，并收集洗脱液，将洗脱液用氮气吹干后，最后用1 mL 2 mL/L甲酸水溶液进行溶解，10 000 r/min涡旋混合1 min，将溶液过膜后，用于上机测定。

1.2.5 色谱和质谱条件 色谱柱为Waters ACQUITY UPLCTMREH C18柱(100 mm×2.1 mm，粒径1.7 μm)；柱温为30℃；样品室温度为室温；流速为0.3 mL/min；进样体积为10μL；流动相A为乙腈，B为1 mL/L甲酸水溶液；梯度淋洗，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

质谱离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式为正离子；毛细血管电压为1.04 kV；源温为150℃；脱溶剂温度为450℃；锥孔气流速为50 L/Hr；脱溶剂气流速为798 L/Hr；7种氟喹诺酮类药物定性、定量离子参数见表2；图1为7种氟喹诺酮类药物的定量离子流图。

表2 7种氟喹诺酮类药物的质谱条件及相关参数

2 结果

2.1 校正曲线和线性范围

称取5.00 g阴性鸡蛋样品，按上述方法处理样品，得到空白基质液，分别加入5种氟喹诺酮类药物混合标准溶液，配制成2.5、5、10、25、50、75、100 μg/L的基质标准溶液。以所得7种氟喹诺酮类药物的离子峰面积平均值为纵坐标、标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。表3为标准曲线回归方程和相关系数。由表3可见，5种氟喹诺酮类药物的浓度在2.5 μg/L～100 μg/L时线性良好，线性相关系数R2均大于0.995 9。

图1 7种氟喹诺酮类药物定量离子流图

2.2 检出限和定量限

样品的检出限(LOD) 是以基质标准曲线上的最低点( 2.5 μg /kg) ，取信噪比S/N=3和样品处理过程的稀释倍数计算得出；样品的定量限(LOQ) 是以基质标准曲线上的最低点(2.5 μg/kg) ，取信噪比S/N=10和样品处理过程的稀释倍数计算得出。环丙沙星和恶喹酸的检测限分别为1.2 μg/kg和0.05 μg/kg，定量限为24 μg/kg和1 μg/kg，其他5种氟喹诺酮类药物的检测限为0.5 μg/kg，定量限10 μg/kg。

2.3 准确度和精密度

将阴性鸡蛋样品称取5.00 g，进行3个水平的回收率试验，浓度分别为100、200、500 μg/kg。将每个水平重复5次，每个浓度做3批，计算相对标准偏差。按照建立的方法处理样品，测定结果见表4。7种氟喹诺酮类药物的平均回收率为36.9%～81.2%。通过测出的各组分的峰面积，计算其相对标准偏差(RSD，sr) ，对该方法的精密度进行衡量，7种氟喹诺酮类药物的批内精密度为2.2%～12.6%，批间精密度为1.8%～15.7%，说明该方法满足检测要求。

表3 7种氟喹诺酮类药物的线性方程和相关系数

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

氟喹诺酮类药物属于酸碱两性化合物，化学结构中有羧基和哌嗪基，流动相中的酸度会对化合物的峰型和响应值产生一定的影响。本试验在流动相中加入甲酸来控制流动相的pH并提高灵敏度，试验中用1 mL/L甲酸水和乙腈进行梯度洗脱。

3.2 提取条件的优化

试验参照国家标准GB/T21312—2007《动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》中加入40 mL EDTA-Mcllvaine提取液，超声提取10 min，10 000 r/min离心10 min。由于鸡蛋中含有大量的蛋白质、脂肪、脂蛋白和色素，以上操作并不能很好的去除脂肪等杂质，因此在固相萃取时提取的上清液很容易阻塞萃取柱，导致试验无法进行。经过试验，在提取的上清液中加入水饱和正己烷去脂后，有利于固相萃取的进行，从而提高净化效率，缩短分析时间。经过多次试验，

表4 空白添加回收率

续表4

药物 Drug添加量/(μg·kg-1) Add amount批次Batch平均回收率/%Average recovery批内相对标准偏差/%Intra-lot relative standard deviation RSD批间相对标准偏差/%Inter-lot relative standard deviation培氟沙星168.36.8Pefloxacin500267.44.04.1363.23.4156.85.4100258.99.64.5362.112.6诺氟沙星145.78.4Norfloxacin200252.77.67.3351.09.2136.97.3500249.24.215.7349.13.0171.96.0100273.59.01.8374.57.9恩诺沙星162.18.6Enrofloxacin200264.75.914.9381.24.2172.012.2500266.24.27.7361.73.8175.45.05100279.32.92.5377.14.2氧氟沙星166.17.4Ofloxacin200271.95.57.0376.05.1170.36.0500268.84.42.7366.64.0157.33.8100254.110.67.1349.76.9恶喹酸147.48.5Oxolinic acid200245.12.83.4344.510.9140.94.6500248.610.010.7340.33.1

每次加入10 mL的水饱和正己烷，在进行了2次去脂后，达到了很好的去脂效果。试验还比较了不同体积的提取液对回收率的影响，分别加入5 mL、8 mL和10EDTA-Mcllvaine缓冲溶液后进行重复提取1次，结果图2所示，除恶喹酸外其他药物加入10 mL提取液的回收率比较高。同时对加入10 mL提取液提取1次和提取2次进行试验，结果如图3所示，加入10 mL提取液提取1次的回收率较高。因此，确定本试验的提取方法为加入10 mL EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取1次。

图2 提取液体积对7种氟喹诺酮类药物回收率的影响

图3 提取次数对7种氟喹诺酮类药物回收率的影响

3.3 纯化条件的优化

鸡蛋中油脂含量较高，如果处理不干净，会影响方法的准确度和结果的稳定性。EDTA-Mcllvaine缓冲溶液中含有许多共萃取物，以脂肪为主，采用高速冷冻离心辅以正己烷脱脂的除脂法，可以有效地去除样品中的脂肪类干扰物。在低温状态下，脂肪粒以固体状态从溶液中析出，未分离的油脂则被正己烷除去，以达到纯化分离的目的。本方法建立中比较了4℃离心和冷冻离心(-4℃)对7种氟喹诺酮类药物回收率的影响，结果在冷冻离心条件下，药物的回收率较高。因此，本方法建立中选择高速冷冻离心辅以正己烷脱脂的除脂法。

3.4 样品的检测

按照上述建立的方法，分别对2017年宁夏地区抽取的51份样品进行检测，结果表明，此次抽取的样品中均未检出含有7种氟喹诺酮类药物残留。

本次建立了一种用高效液相-串联质谱快速检测鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留的方法，能满足鸡蛋中7种氟喹诺酮类药物检测的要求。本次建立的方法在国家标准GB/T21312—2007《动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》的基础上，对样品前处理的过程进行了优化，使样品的处理快捷便利，灵敏度高，选择性好，且能高效、快速地检测多种抗生素，可有效应用于鸡蛋品质的监控。