头孢拉定胶囊微生物限度检查方法的验证

高 菲

(大连市第三人民医院药剂科，辽宁 大连 116033)

微生物限度检查是评价原料药、辅料及非最终灭菌制剂受到微生物污染程度的方法[1]，其可确保生产企业所用的原料药、辅料、生产设备、生产器具、生产环境及生产操作人员的卫生状况符合法规标准[2]。文献报道，微生物限度检查主要包括总需氧菌数、霉菌数和酵母菌数检查，并需对控制菌进行专属性检查[3-4]。然而，工作环境、样品性质及试验方法均会影响检查方法的准确性[5]。因此，行微生物限度检查前的首要任务是进行方法学验证，以确保所选择检查方法对药品适合；尤其对于含有抑菌剂的药品，其成分可能会在微生物限度检查时抑制药品中的微生物生长，导致检测方法不准确[6-7]。本研究按照《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)“1105”“1106”的相关规定，对头孢拉定胶囊微生物限度检查方法进行适用性试验，以确保在实际检验条件下，检验用物品(包括供试品、稀释液、淋洗液、培养基及检验器具等)和操作程序对可能存在的微生物生长不会造成不良影响，检测方法准确、有效并可重现。头孢拉定胶囊是β-内酰胺类广谱抗菌药物，对于细菌有较强的抗菌作用[8]。参考相关文献[9]，本研究采用平皿法及稀释法检测总需氧菌、霉菌和酵母菌总数，采用薄膜过滤法检测控制菌，以确认头孢拉定胶囊在规定的检验量和检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性被充分消除到可以忽略不计，得到的检验结果准确、可靠。

1 材料

1.1 仪器

ZHJH-C1112C型超净化工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；XG1.DWS-1.2B型蒸汽灭菌柜(山东新华医疗器械股份有限公司)；HR40-ⅡA2型生物安全柜(上海恒勤仪器设备有限公司)；BL-610型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；SHH-250 L型生化培养箱(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)；MJX-250C型霉菌培养箱(20～25 ℃，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)；MJX-250C型霉菌培养箱(30～35 ℃，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)。

1.2 药品

头孢拉定胶囊(批号：46170402、46170403和46170404)，购自上海新亚药业闵行有限公司。

1.3 实验用菌种

白色念珠菌[工作菌种号：CMCC(F)98001]、金黄色葡萄球菌[工作菌种号：CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[工作菌种号：CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[工作菌种号：CMCC(B)63501]、黑曲霉[工作菌种号：CMCC(F)98003]及大肠埃希菌[工作菌种号：CMCC(B)44103]，均来源于中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心。

1.4 培养基

沙氏葡萄糖液体培养基(批号：150321)；沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号：150824)；胰酪大豆胨液体培养基(批号：150521)；胰酪大豆胨琼脂培养基(批号：150224)；麦康凯液体培养基(批号：150824)；麦康凯琼脂培养基(批号：150907)；pH 7.0氯化钠-蛋白胨(批号：150123)。上述培养基均来源于北京三药科技发展有限公司。

2 方法与结果

2.1 验证依据

根据《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)“1105”“1106”的相关规定。

2.2 菌液的制备

在新鲜的胰酪大豆胨液体培养基中接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌，在30～35 ℃条件下持续培养18～24 h；在沙氏葡萄糖液体培养基中接种白色念珠菌，在20～25 ℃条件下持续培养24～48 h；在沙氏葡萄糖琼脂培养基中接种黑曲霉的新鲜培养物，在20～25 ℃条件下持续培养5～7 d，加入无菌0.9%氯化钠溶液，洗脱孢子，使用带有刻度标记的无菌吸管吸出孢子悬液至无菌试管内；将上述6种细菌培养物种加入无菌0.9%氯化钠溶液，配制成含菌数<100 cfu/ml的微生物混悬液。在室温(25 ℃)下保存的菌液需在2 h内使用，在2～8 ℃保存的菌液需在24 h内使用。黑曲霉孢子悬液保存在2～8 ℃，可在1周内使用[10]。

2.3 总需氧菌、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验(平皿法)

2.3.1 供试液的制备：准确称取头孢拉定胶囊10 g，加入pH为7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，置于45 ℃恒温水浴中振摇使其溶解，制成1∶10的供试液。

2.3.2 试验组操作过程：分别移取5份供试品溶液，各9.9 ml，分别加入试验菌液(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌)各0.1 ml，摇匀，每份样品溶液中含菌数<100 cfu/ml。分别从5份试验菌试管中吸取1 ml至平皿中，加入胰酪大豆胨琼脂培养基(温度为30～45 ℃)15～20 ml，混匀，凝固，用于需氧菌总数测定。另外，分别从真菌(白色念珠菌、黑曲霉菌)试验菌试管中吸取1 ml至平皿中，并加入沙氏葡萄糖琼脂培养基(温度为30～45 ℃)15～20 ml，混匀，凝固，用于霉菌和酵母菌总数测定[11]。每种试验菌平行操作3次，取平均值。

2.3.3 菌液对照组操作过程：吸取pH为7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9 ml，共2份，分别加入与试验组相同的菌液后混匀。其他操作同试验组。

2.3.4 供试品对照组操作过程：分别吸取1∶10供试液1 ml至4个平皿，其中2个平皿倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，另2个平皿倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀。

2.3.5 培养及判断标准：待所有试验用平皿凝固后，将所有总需氧菌平皿倒置，于30～35 ℃条件下培养3～5 d；霉菌和酵母菌平皿倒置，于20～25 ℃条件下培养5～7 d，每日观察并记录结果。重复操作，直至做完所有待验证的3批供试品。各菌株回收率=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液对照组平均菌落数。在3次独立的平行试验中，若各菌株回收率在0.5～2范围内，则该适用性试验结果满足要求[12]。

2.4 需氧菌总数计数方法适用性试验(培养基稀释法)

取1∶10 供试液清液分别注入5个平皿中，每个平皿0.2 ml，同时加入含菌数≤100 cfu的试验菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌)，立即注入温度≤45 ℃的胰酪大豆胨琼脂培养基15～20 ml，混匀，凝固，用于需氧菌总数测定[13-14]。其菌落数及回收率计算方法同平皿法。

2.5 大肠埃希菌方法适用性试验(薄膜过滤法)

2.5.1 试验组操作过程：取“2.3.1”项下供试液10 ml，加入无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH=7.0)100 ml，混匀，过滤。滤膜用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH=7.0)100 ml冲洗，重复冲洗3次，并在最后1次冲洗液中加入<100 cfu/ml的大肠埃希菌液。将带有肠埃希菌的滤膜接入到胰酪大豆胨液体培养基100 ml中，30～35 ℃条件下培养18～24 h。取上述培养物1 ml接种至麦康凯肉汤培养基100 ml中，42～44 ℃条件下培养24～48 h，取麦康凯肉汤培养物划线并接种到麦康凯琼脂平板上，30～35 ℃条件下培养18～72 h[15-16]。每日观察并记录结果。

2.5.2 阳性对照组和阴性对照组操作过程：阳性对照组除不加样品外，其余操作同试验组。阴性对照组取稀释液10 ml代替样品，不加大肠埃希菌，其余操作同试验组。

2.5.3 判断标准：若试验组检出试验菌，阳性对照组检出试验菌，阴性对照组无菌生长，则该方法适用性试验结果满足要求。

2.6 菌液的制备结果

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌均制成含菌数<100 cfu/ml的菌液，见表1。

表1 菌液制备及菌落计数Tab 1 Preparation of bacterial suspension and colony counting

2.7 菌落计数及回收率测定结果(平皿法)

在3次独立的平行试验中，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的回收率均<0.5，未达到要求；白色念珠菌、黑曲霉菌菌落回收率>0.7，符合规定，见表2。

表2 菌落计数及回收率测定结果(平皿法)Tab 2 Colony count and recovery results (plate method)

2.8 菌落计数及回收率测定结果(培养基稀释法)

在3次独立的平行试验中，常规平皿法回收率达不到要求，而通过培养基稀释法(1∶50)金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的回收率均>0.7，达到要求，见表3。

表3 菌落计数及回收率测定结果(培养基稀释法)Tab 3 Colony count and recovery results (medium dilution method)

2.9 大肠埃希菌检查方法验证试验结果

阳性对照组和样品试验组大肠埃希菌对照菌均检出，而阴性对照组未检出，表明该方法有效，见表4。

表4 大肠埃希菌检查方法验证试验结果Tab 4 Verification results of Escherichia coli test method

注：“+”为大肠埃希菌对照菌检出；“-”为大肠埃希菌对照菌未检出

Note: “+” indicates the detection of Escherichia coli control bacteria; “-” indicates the Escherichia coli is not detected

3 讨论

微生物限度方法学验证是确认供试品在所采用的检查方法和检验条件下无抑菌作用，以保证供试品污染的微生物能被充分检验出来[17]。本研究通过对头孢拉定胶囊微生物限度进行方法学验证，最终确认了该药日常微生物限度的检测方法。检验结果标准规定：需氧菌总数不得超过200 cfu/g；霉菌和酵母菌数不得超过40 cfu/g；大肠埃希菌每1 g不得检出。检验结果若符合标准规定则说明该批次头孢拉定胶囊符合《中华人民共和国药典》(2015年版)要求，可以对外销售，消费者可以安全服用；若不符合标准规定，则说明该批次药品受到微生物污染，应立即销毁，防止外售。

头孢拉定属于第1代半合成头孢菌素，具有较高的水溶性，对金黄色葡萄球菌及其他多重耐药菌具有广谱抗菌作用。本研究在前期预实验时，对比了采用同稀释级别的培养液稀释法和薄膜过滤法考察金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的回收率。采用培养液稀释法人工污染3种细菌的回收率均为0；而培养液稀释法通过滤膜，其对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的平均回收率要高于采用薄膜过滤法，说明培养液稀释法适用于金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的检测。