微探头超声破碎辅助提取-HPLC-ICP/MS快速测定海产品中甲基汞

(淮安市疾病预防控制中心，淮安 223001)

1 引 言

无机汞(Hg2+)和甲基汞(CH3Hg+)是生物样品中最为常见和丰富的两种汞形态[1]。汞在环境中的毒性，生物特性和转运取决于其化学形态[2]。众所周知，有机汞毒性远大于无机汞。无机汞在水生生物体内甲基化形成甲基汞并在海洋生物中通过食物链进行富集[3]，汞的生物蓄积性最密切的几个因素是鱼类的大小和/或脂肪含量[4,5]，蛋白亲和机制[6]以及鱼类栖息地中溶解氧的含量[7]。

从复杂基质样品中提取形态汞是其测定前的最关键步骤。汞形态分析需要较高的提取效率，更重要的是需要在分析前保持原始价态的完整性[8]。汞对巯基有较高的亲和力，使得L-半胱氨酸和2-巯基乙醇成为超声提取形态汞的两种常用试剂。蒸馏法、酸和碱提取法等多种提取方法在样品制备过程中容易使无机汞转化为甲基汞[9,10]，为了避免这种情况发生，常用的方法是在中等温度和pH下从生物组织中提取形态汞[11]。一些研究表明，汞提取效率随着2-巯基乙醇浓度的增加而增加[8]。

超声辅助提取现在是一种非常有前途的汞形态前处理提取技术。已有学者通过这种提取方式并采用HCl溶液从鱼肉组织中获得较高的提取效率[12]。另外，酶通过作用于特定化学键可以避免汞化学形式改变[13]，酶水解已用于样品中形态汞的提取[10]。采用超声波探头可以有效减少萃取时间，目前该技术已成功应用于多种基质中形态硒的酶水解提取[14]。

本研究在现有研究方法的基础上对比分析酸浸提和酶水解分别在超声辅助下对海产品中甲基汞提取效率的影响，并对超声振幅、超声时间、萃取剂用量和样品量等前处理参数进行细化比较，筛选出简单快速、准确可靠，适用于海鲜产品中甲基汞定量提取的前处理方法。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

XⅡ型电感耦合等离子体质谱仪(美国热电公司)；1260型高效液相色谱仪(配自动进样器，美国安捷伦公司)；Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美国安捷伦公司)；超纯水仪(德国密理博公司)；超声波细胞粉碎机(上海辛苪仪器设备有限公司)；DELTA 320型pH计(美国梅特勒-托利多公司)；H-1850R型高速离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；塑料瓶和玻璃器皿在10%HNO3中浸泡24小时，去离子水漂洗5次，干燥后使用。

2-巯基乙醇(分析纯，美国Merck公司)；L-半胱氨酸(日本东京化成工业株式会社)，蛋白酶XIV和脂肪酶(上海如吉生物科技发展有限公司)。Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L)(北京索莱宝科技有限公司)；氧化汞(光谱纯，德国Merck公司)；甲基汞标准品(德国Dr.Ehrenstorfer公司)；金枪鱼中甲基汞标准物质(CRM-463)(欧盟标准委员会)；硝酸、盐酸(优级纯，美国Merck公司)。

2.2 方法

2.2.1 样品前处理

准确称取50 mg样品至5 mL聚丙烯试管，分别加入2 mL酸浸提溶液和酶水解溶液进行提取，将样品置于超声波细胞粉碎机中以40%振幅超声提取。超声完成后7600 r/min离心15 min，0.22 μm滤膜过滤后上机。样品提取一式三份，并以相同的方式制备空白样。

2.2.2 仪器条件

以时间分辨分析模式进行定量，HPLC-ICP-MS详细仪器参数见表1。

表1 HPLC-ICP-MS系统的参数

3 结果与讨论

3.1 提取效率评估

研究中比较了几种基于超声波探针超声提取的操作程序，分别采用酸浸提和有无汞络合剂(L-半胱氨酸和2-巯基乙醇)酶水解提取方法。酸浸提法考察了不同浓度HCl溶液提取效果，并对超声时间和超声振幅强度等条件进行了考察。酶水解方法通过固定超声参数考察蛋白酶并添加不同比例脂肪酶及其与不同浓度缓冲溶液配伍对甲基汞萃取效率的影响，同时观察添加不同比例汞络合剂(L-半胱氨酸和2-巯基乙醇)对酶水解提取效率的影响。

3.1.1 酸水解条件优化

酸水解法是汞提取最常用的方法之一[13]。采用盐酸释放与蛋白结合的甲基汞比硝酸或乙酸更有效[15]。

通常酸浸提法的提取效率基本上由酸浓度，超声时间和超声振幅决定。本研究在超声振幅为40%和60%的条件下，分别在5 min和10 min内考察1、3、5和7 mol/L 4种浓度盐酸溶液对金枪鱼中甲基汞标准物质的提取效率，提取方法按照2.2.1中操作步骤进行。提取液中甲基汞含量采用2.2.2中HPLC-ICP-MS方法进行检测，结果显示标准物质中甲基汞回收率随着HCl浓度的增加而增加，采用7 mol/L盐酸回收率最高可达99±3%(图1)。可能原因是由于HCl在浓度低于7 mol/L时，金枪鱼组织颗粒中仍存在汞残留。研究显示较短的超声时间能获得更好的提取效果，与5 min相比，超声处理10 min回收率则显著下降，可能原因是在超声处理过程中汞被氧化而挥发损失。所以本方法选择5 min作为最佳超声时间。同时实验中发现甲基汞提取效率随着超声振幅由40%增加至60%而降低，原因是高幅震动会使提取溶液产生大量空泡，从而影响超声能量传导。超声波探头的优点是可以处理微量样品，本研究中采用不同浓度HCl溶液分别对5 mg和50 mg标准参考物质进行提取，图2结果显示5 mg回收率没有明显低于50 mg，可能原因是5 mg样品量太小导致均质性不足。因此，本研究中选择50 mg样品作为最终质量参数，采用7 mol/L盐酸溶液以40%振幅超声提取5 min。

图1 不同超声时间对各浓度HCl提取液回收率的影响

图2 各浓度HCl提取液对不同质量样品的提取效率

3.1.2 酶提取条件优化

使用HCl作为萃取溶剂的ICP-MS定量汞形态分析方法存在以下几个缺点：信号衰减、吸入溶液粘度的变化以及雾化效率和气溶胶运输的改变[16]。此外，高浓度的HCl溶液会影响超声变幅杆的性能。本研究除了探讨HCl的提取效果外，针对不同酶混合物的酶提取方式进行了评价。实验中取50 mg金枪鱼中甲基汞标准物质按照2.2.1操作步骤采用不同酶水解提取方式(表2)进行提取，提取完成后将不同酶提取液上机检测，HPLC-ICP-MS仪器参数按2.2.2设置。表2显示不同酶类在超声辅助下的提取效率。其中仅采用蛋白酶XIV进行水解提取的回收率均未超过40%，为了提高萃取效率，实验中额外添加了其他酶类，并使用pH等于7.5的缓冲液提高酶活性以及使用汞络合剂等方法进行改进。从结果看添加脂肪酶反而降低了回收率，且与添加量无关。在水溶液中添加0.25%(w/v)的L-半胱氨酸以及在pH7.5的缓冲溶液中添加0.5%的L-半胱氨酸进行提取的回收率在40%左右。从结果看，2-巯基乙醇对提取效率有明显的提升，回收率随2-巯基乙醇的浓度增加而提高。当萃取溶液含有2.5%(v / v)的2-巯基乙醇和0.75%(w / v)的蛋白酶XIV时提取效率最高。其他研究报道中同样观察到采用2-巯基乙醇替代L-半胱氨酸进行汞提取，回收率获得显著提高[17]。另外，实验中通过增加2-巯基乙醇百分比(5%(v / v))，以及对固体残余物进行二次水解，都没有获得提取效率的明显改善。因此，本实验中选择2.5%(v / v)2-巯基乙醇和0.75%(w / v)蛋白酶XIV的水溶液作为海产品中甲基汞的酶水解提取溶液。

表2 不同酶水解对金枪鱼标准物质中甲基汞的提取效率

3.2 HPLC-ICP-MS分析汞的形态

很多报道指出超声会导致价态的转化[18]，所以本研究采用LC-ICP-MS分析了2-巯基乙醇进行酶水解得到的提取物。根据以前的研究方法[19]，选取C18色谱柱，0.1%w / v的L-半胱氨酸+ 0.1%w / v的L-半胱氨酸HCl H2O为流动相。向流动相添加0.1%(w/v)L-半胱氨酸可以防止色谱柱中汞的残留和ICP-MS[20]中色谱峰中出现长拖尾。从图3所示的甲基汞和无机汞标准品的洗脱图中可以看出(使用表1中给出的分离条件)，两种汞的分离只需要大约4 min。

图3 无机汞和甲基汞标准色谱图(10 μg/L)

3.3 方法学验证

配制系列浓度的标准溶液并分别进行测定，在1～20 μg/L浓度范围内甲基汞的相关系数(r)为0.996，具有很好的线性相关性。在方法规定的取样质量条件下，按本方法测定标准参考物质，根据色谱响应值S/N≥3标准计算检出限，甲基汞的检出限为0.1 μg/kg。研究中按实验方法对标准参考物质进行提取、净化和检测，测定回收率；1天内重复测定6次，计算日内精密度；3天内重复测定6次，计算日间精密度，本方法甲基汞的日内精密度为2.7～7.5%，日间精密度小于14%。这表明该方法的回收率和精密度较好，能满足汞形态分析的要求。

3.4 市售海鲜样品中汞的形态

对于所提出的方法的应用，在当地超市购买了不同类型的海鲜样品(基围虾，章鱼，鱿鱼，罗非鱼，金枪鱼，三文鱼)，并通过提出的方法进行分析。结果见表3。根据GB2762—2012食品中污染物限量规定本次所测水产品的甲基汞含量均低于国家标准[21]。但由于甲基汞的生物链富集作用，位于食物链顶端的海产品中具有较高的含量，在日常饮食中应谨慎食用。

表3 本市市售的部分水产品甲基汞含量

4 结论

本研究分别采用酸浸提和酶水解提取两种方法并结合使用超声波探头实现海鲜样品中汞的定量提取。虽然本研究中酸浸提回收率(99±3%)高于酶水解提取(91±4%)，但由于酸浸提方法除本文中所述缺点外，提取液中和后的盐分容易影响色谱柱柱效，所以实际工作中选择酶水解提取方法作为甲基汞提取方法。本研究中采用微探头超声波破碎的辅助提取方式使得样品制备程序更加简单快速，在5 min内可以实现甲基汞的定量提取。方法检出限低，线性范围宽，适用于小样本的提取制备，回收率和精密度均满足日常检测要求。该方法已成功应用于本地市场海鲜样品中的甲基汞形态分析，为食品中甲基汞的检测提供参考。