超高效液相色谱-串联质谱法检测牛奶中双氯芬酸钠残留

2018-08-14*

分析仪器 2018年4期

(1. 北京市兽药监察所，北京 102600； 2. 首都师范大学化学系，北京 100048)

双氯芬酸钠又名双氯灭痛，其化学结构式如图1所示，是常用非甾体类抗炎镇痛药[1，2]，通过抑制环氧化酶活性减少前列腺素的合成，同时可间接抑制白三烯的合成而发挥解热、镇痛及抗炎的作用[3]，在兽医临床上主要作为中小动物的解热镇痛药，用于发热、肌肉痛、关节痛和风湿痛等[4]。人体长期服用双氯芬酸钠口服制剂可造成胃肠刺激、神经性头痛及电解质紊乱等不良反应[5]。欧盟规定双氯芬酸钠在牛和猪可食性组织中的残留标识物为双氯芬酸，在牛奶中最大残留限量(MRL)为0.1 μg/kg[6]，我国尚未批准该制剂用于兽医临床[7]。

图1 双氯芬酸钠化学结构式

目前，双氯芬酸钠检测方法主要有液相色谱法[8]、气相色谱法[9]、液相色谱-串联质谱法[10，11]、高效液相色谱-串联质谱法[12-14]及毛细管电泳法等。液相色谱法抗干扰能力差且灵敏度不能满足检测要求；气相色谱法样品衍生化前处理繁琐且会带来副反应。高效液相色谱-串联质谱法由于无需对样品进行衍生化处理，且分析时间短，灵敏度高，重现性好，将是未来双氯芬酸钠残留检测的发展方向。

本实验建立了牛奶中双氯芬酸钠残留测定的超高效液相色谱-串联质谱方法，具有快速、准确、灵敏度高的优点。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 仪器

超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)；电子分析天平(北京赛多利斯有限公司)；高速冷冻离心机(日本HITACHI 公司)；氮吹仪(Organomation Associates 公司)；溶剂过滤器(美国PALL公司)；旋涡混合仪(德国IKA公司)等。

1.1.2 试剂

双氯芬酸钠标准品及其同位素标记物均购自德国Dr公司，纯度≥98.0%；乙腈、甲醇，色谱纯，甲酸，质谱级，均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；乙酸乙酯、正己烷、氯化钠，分析纯，均购自北京化工试剂厂。其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 牛奶样品前处理

取供试样品10 g±0.5 g于50 mL离心管中，加入100 μL双氯芬酸钠13C同位素标记物标准工作液，高速涡旋1 min，静置10 min；加入10 mL乙腈及1 g乙酸铵，高速涡旋2 min，4℃下4500 r/min离心20 min。取上清液转入15 mL带盖聚丙烯离心管中，加入乙腈饱和过的正己烷3 mL，涡旋混匀1 min，4℃下4500 r/min离心10 min，弃去上层正己烷和下层水相；乙腈提取液于50℃下浓缩至干，加入1 mL流动相，涡旋振荡并水浴超声，使残渣完全溶解，样品过0.22 μm滤膜过滤，供超高效液相色谱-串联质谱分析。

1.2.2 液相色谱参考条件

液相色谱条件：C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：乙腈-0.1%甲酸水(55+45)；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；柱温：室温。

1.2.3 质谱参考条件

离子源：电喷雾(ESI)离子源；检测方式：多反应监测(MRM)；扫描方式：正离子扫描；电离电压：3.0 kV；源温：150℃；雾化温度：450℃；锥孔气流速：150 L/h；雾化气流速：800 L/h。

1.2.4 标准曲线绘制

精密称取适量双氯芬酸钠标品，用乙腈溶解配制成质量浓度为1 mg/mL贮备液，再用乙腈稀释配制5个不同浓度的标准工作液(0.05、0.1、0.5、3.0、5.0 ng/mL)，以双氯芬酸钠特征离子质量色谱峰面积对双氯芬酸钠13C同位素标记物(内标)特征离子质量色谱峰面积的比值为纵坐标，空白试料加标后被测物的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

采用C18反相色谱柱可使双氯芬酸钠较好分离，本研究结果表明柱长50 mm，柱内径2.1 mm, 粒度1.7 μm，C18反相色谱柱对双氯芬酸钠分离效果最好。以乙腈-0.1%甲酸水(55+45)作为流动相，进样量5 μL，流速0.3 mL/min。结果表明乙腈-0.1%甲酸水做流动相对双氯芬酸钠有良好的色谱分离效果，可兼顾质谱响应，色谱峰峰形较优。

2.2 质谱条件优化

根据双氯芬酸钠含有羧基的特点，可在酸性条件下用正离子模式检测，一级全扫描质谱得到准分子离子峰([M+H]+)为296，可以看出双氯芬酸钠在酸性溶液中掉了个[Na+]，加了个[H+],调节毛细管电压，锥孔电压，使其丰度最大，进行二级质谱分析，选择离子中丰度最大的两个离子作为定量和定性离子，对各参数进行优化，质谱参数条件如表1。

表1 双氯芬酸钠及其同位素标记物定性定量离子对、锥孔电压和碰撞能量

2.3 方法学考察

2.3.1 线性范围

在最佳色谱条件下，配制标准工作液浓度0.05、0.1、0.5、3.0、5.0 ng/mL，双氯芬酸钠标准曲线见图2。

图2 双氯芬酸钠标准曲线

结果表明，在0.05～5 ng/mL浓度范围内双氯芬酸钠色谱峰面积与浓度呈良好线性相关，回归方程：y= 0.9654x+0.0214；相关系数R2为0.9996。

2.3.2 检测方法灵敏度

方法检测限(LOD)和定量限(LOQ)：按照药物选择离子响应色谱峰信噪比S/N>3(按PtP算)确定检测限；按照药物选择离子响应色谱峰的信噪比S/N>10(按PtP算)确定定量限。

添加适量标准溶液于10 g空白牛奶中，分别制备得到0.02 μg/kg和0.05 μg/kg的添加样品，按检测步骤处理样品、检测。结果表明，牛奶中双氯芬酸钠检测限(LOD)为0.02 μg/kg，定量限(LOQ)为0.05 μg/kg。

2.3.3 准确度和精密度

选取空白样品进行空白添加实验，验证该方法的准确度和精密度，标准溶液、加标牛奶和实际牛奶样品中双氯芬酸钠MRM色谱图见图3～图5。添加浓度为0.05、0.1、2.0 μg/kg，每个浓度设5个平行，连续做3天，计算添加回收率、日内变异系数和日间变异系数。在三个浓度添加水平下，平均回收率为97.6%～113.0%，日内变异系数0.5%～9.5%，日间变异系数1.8 %～7.4 %。方法回收率高，精密度好，检测方法准确度及精密度结果见表2。