不同生育期水稻对甲基汞的蓄积

张志渊，胡文俊，卢 畅，官甲训，王 敏，李云云，王 果

（福建农林大学资源与环境学院，福建 福州350002）

0 引言

【研究意义】稻米是我国居民甲基汞暴露的重要途径，研究水稻不同生育期对甲基汞的吸收、转运能力有助于降低汞污染地区居民甲基汞暴露的风险。【前人研究进展】汞是一种重要的全球性污染物，因其具有持久性、强烈的神经毒性、易通过食物链富集放大等特点，被世界卫生组织、联合国环境规划署等许多国际组织列为优先控制污染物[1−2]。我国是世界上生产、消费和排放汞最多的国家之一，各种来源的汞通过干湿沉降、污水灌溉、污泥施肥、尾矿堆放等方式进入到土壤。2014年发布的《全国土壤污染状况调查公报》以及2016年发布的《土壤污染防治行动计划》（土十条）都显示我国正面临着严重的土壤汞污染问题。矿业废弃地周边土壤汞污染问题尤其突出，如我国贵州万山汞矿区周边土壤汞含量高达790mg·kg−1[3]，金矿开采中使用汞齐试剂也导致了严重的土壤汞污染[4−5]。土壤汞污染导致粮食汞含量升高，采集自我国9个省市市场的303份大米样品测定结果显示约12%的样本中汞含量超过国家标准规定的粮食汞含量限量值（20μg·kg−1，GB 2762—2017）[6]。相比于无机汞，甲基汞毒性更强。研究表明水稻植株从根部到稻米，甲基汞占总汞的比例越来越高，稻米中甚至有超过70%的汞是以甲基汞的形式存在[7−8]。近期一项全国尺度的风险评估研究表明，我国居民6%～95%的膳食甲基汞来自于摄食稻米[9]，说明食用污染稻米是中国居民甲基汞暴露主要途径。近期的研究发现稻田环境中好厌氧交替、微生物群落、有机质供给等特殊条件导致了稻田中甲基汞的大量生成[10−12]，而稻田甲基汞是水稻甲基汞的主要来源[13]。不同的生育期水稻根际环境氧化还原状态不同，如最大分蘖前期，根际环境处于强还原状态；从最大分蘖期到拔节期，由于茎节的形成以及根系分泌物的增加，根际还原性减弱[14]。氧化还原条件的改变能够通过影响土壤中汞的有效性、根表铁膜的形成等进而影响水稻对于甲基汞的吸收、转运，如土壤汞的有效性及根表铁膜的形成与土壤中硫、铁及其相互作用密切相关[15−16]。【本研究切入点】不同生育期根际氧化还原状态不同，水稻对甲基汞的吸收能力是否相同，稻米中甲基汞的累积主要发生于哪个生育期?早期的研究发现水稻根组织和茎叶组织在幼苗期存在明显的甲基汞的去甲基化现象[17−18]，这个现象是否也存在于其他时期？这些问题尚不清楚，需要进一步研究。【拟解决的关键问题】本研究采用水培的试验方法，定量计算不同时期（幼苗期、分蘖期、拔节期和抽穗期）甲基汞的暴露对稻米甲基汞蓄积的影响以及无机汞和甲基汞在水稻体内的分配比，为降低稻米甲基汞蓄积提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 水稻幼苗培养

试验选用福建省广泛种植的水稻品种甬尤9号。首先挑选颗粒饱满的水稻种子，用10%的氯化钠溶液消毒10m in后用流水冲洗5 h，紧接着用二次水冲洗干净。消毒的水稻种子转移到铺有润湿滤纸的培养皿中，在30℃黑暗的条件下萌发一周后，将水稻幼苗置于50%的Hogland培养液中继续培养。待水稻幼苗高度接近10 cm时，挑选高度接近、长势接近的水稻幼苗转移到250m L的烧杯中继续培养3周。

1.2 试验处理

培养3周后，将高度接近的水稻幼苗转移至包有锡箔纸的塑料桶（高20 cm，直径15 cm），利用25%的Hogland培养液进行培养。试验共设5个处理组，分别为：空白组（水稻生长整个生育期没有甲基汞暴露）、幼苗期组（水稻种子萌发1周后即进行甲基汞暴露）、分蘖期组（水稻生长40 d进行甲基汞暴露）、拔节期组（水稻生长80 d进行甲基汞暴露）、抽穗期组（水稻生长120 d进行甲基汞暴露）。每个处理组甲基汞暴露的时间均为一周。水稻根组织在暴露结束后进行二次水冲洗，并更换为无汞培养液培养。试验时间为2020年5月到10月，每个试验处理组重复3次，每组含2株幼苗，甲基汞的暴露浓度为50μg·L−1。

1.3 分析方法

水稻成熟后，移出培养器。充分清洗水稻根组织后，将水稻分为根、秸秆、稻米三部分。根组织首先用二次水冲洗干净，然后用谷胱甘肽溶液进一步浸泡冲洗以除去水稻组织表面吸附的汞。将水稻各个组织冷冻干燥，而后研磨过筛。水稻各个组织中甲基汞含量的测定方法如下：称取约50 mg的水稻样品于15 m L离心管（Coring）中，加入2m L 25%（w t/w t）氢氧化钾-甲醇溶液，超声辅助充分混合后，于60℃的恒温振荡器中振荡提取4 h，在振荡过程中拿出超声混匀3次。振荡结束后，取出冷却，之后用二次水定容，定容体积为10m L。常温下使用4000 r·m in−1转 速 离 心30 m in，而 后 量 取50～100μL的上清溶液至40m L的棕色瓶，并加入0.5～1.0m L的缓冲试剂（柠檬酸/柠檬酸钠），二次水加满后加入50μL乙基化试剂，拧紧盖子摇匀后，静置10 m in采用气相色谱冷原子荧光（CVAFS，Brooks Rand，USA）进行测定。早期研究表明，甲基汞暴露后水稻根组织中总汞含量远大于秸秆和稻米组织，且甲基汞向上转运的能力高于无机汞[17−18]。因此这里只对水稻秸秆和稻米进行总汞的分析。水稻样品中总汞含量采用DMA-80固液相直接测汞仪（M ilestone DMA-80,Italy）测定。为保证实验的精准性，样品中总汞和甲基汞含量选用标准物质（GBW 10010和DORM-3）计算回收率。GBW 10010和DORM-3的回收率为86%～108%（n=6）。

1.4 数据分析

采用Origin 8.5及Sigma plot12.5软件进行数据计算、统计和作图。差异性分析采用LSD法，差异显著水平为5%。

2 结果与分析

2.1 水稻根系甲基汞

不同处理组中水稻根系甲基汞含量如图1所示。由图1可知，空白组水稻根系中甲基汞的含量为8.32±0.84μg·kg−1，甲基汞暴露显著增加了根系甲基汞含量。在水稻生长的幼苗期和分蘖期暴露甲基汞，根系甲基汞含量无显著差异，但和空白组相比，根系甲基汞提高1.98倍（幼苗期组）和2.01倍（分蘖期组）。拔节期组和抽穗期组根系甲基汞的含量显著高于幼苗期组和分蘖期组，约为空白组的31.41倍（拔节期组）和79.04倍（抽穗期组）。5个处理组根系甲基汞含量依次为抽穗期组＞拔节期组＞分蘖期组＞幼苗期组＞空白组。

图1 不同处理组根系甲基汞含量Fig.1 M eHg contents in roots of rice p lants under different treatments

2.2 水稻秸秆总汞和甲基汞

不同处理组水稻秸秆甲基汞、总汞及秸秆中甲基汞占总汞的比例如图2所示。由图2可知，不同处理组中秸秆甲基汞的分布规律和根系甲基汞相同，拔节期组和抽穗期组秸秆甲基汞含量均显著高于空白组、幼苗期组和分蘖期组。拔节期组秸秆甲基汞含量是其他3个处理组的27.58倍（空白组）、17.06倍（幼苗期组）和24.61倍（分蘖期组）。抽穗期组秸秆甲基汞含量为空白组的40.47倍，幼苗期组的25.03倍，分蘖期组的36.11倍。

图2 不同处理组秸秆甲基汞含量（A），秸秆总汞（B）和秸秆甲基汞/总汞（C）Fig.2 Contents of M eHg(A)and total Hg(B)and percentages of M eHg to total Hg(C)in straws of rice plants under different treatm ents

由图2可知，秸秆总汞含量变化规律与秸秆甲基汞一致。拔节期组和抽穗期组中秸秆总汞含量显著高于空白组、幼苗期组和分蘖期组。拔节期组秸秆总汞相对于其他3组增加量分别为558.36%（空白组）、110.51%（幼苗期组）和195.85%（分蘖期组）。抽穗期组秸秆总汞增加量约为空白组、幼苗期组和分蘖期组秸秆总汞的634.13%、131.23%和224.97%。抽穗期组秸秆总汞与拔节期组无显著差异。

由图2可知，秸秆中甲基汞占总汞的比例与甲基汞的暴露时期密切相关。具体表现为：幼苗期组和分蘖期组中甲基汞占总汞的比例没有显著差异，且两组秸秆中的汞大部分（＞70%）以无机汞的形式存在。拔节期组和抽穗期组的秸秆甲基汞占总汞比例显著高于其他3个处理组，而两组秸秆中有超过60%的汞是以甲基汞的形式存在。

2.3 水稻稻米总汞和甲基汞

不同处理组的稻米甲基汞、总汞以及稻米甲基汞占总汞比例如图3所示。从图3可以看出，不同处理组稻米甲基汞含量变化规律与秸秆、根系甲基汞类似，均表现为水稻生育后期甲基汞暴露组显著高于生育前期甲基汞暴露组。幼苗期组和分蘖期组中稻米甲基汞含量没有显著差异。抽穗期组稻米甲基汞含量约是其他4个组的119.66倍（空白组）、14.52倍（幼苗期组）、20.53倍（分蘖期组）和2.06 倍（拔节期组）。

图3 不同处理组稻米甲基汞含量（A），稻米总汞（B）和稻米甲基汞/总汞（C）Fig. 3 Contents of M eHg (A) and total Hg (B) and percentages of M eHg to total Hg (C) in grains of rice p lants under different treatments

不同处理组中稻米总汞含量变化规律与稻米甲基汞一致，具体表现为：空白组稻米总汞含量为8.23 ± 0.59 μg·kg−1，低于其余4个处理组。幼苗期组和分蘖期组稻米总汞含量都显著低于拔节期组和抽穗期组。抽穗期组稻米总汞含量为其他4个处理组 的1775.46%（空 白 组）、1021.73%（幼 苗 期组）、1644.07%（分蘖期组）和105.01%（拔节期组）。

稻米中甲基汞占总汞的比例同样与甲基汞的暴露时期相关，具体表现为：幼苗期组稻米甲基汞占总汞的比例最低，其次是分蘖期组。抽穗期组和拔节期组间没有显著差异。幼苗期组和分蘖期组稻米中有超过60%的汞是以甲基汞的形式存在，而在拔节期组和抽穗期组稻米总汞绝大部分（＞80%）是甲基汞，无机汞所占的比例不到总汞的20%。

3 讨论

甲基汞具有神经毒性，可沿着食物链富集，常见食品中有着较高浓度的富集[水产品（3530 μg·kg−1）、稻米（67.0 μg·kg−1）][9,19]。本研究结果显示水稻各组织中甲基汞含量与甲基汞暴露的时期密切相关，即水稻生育后期暴露更有利于甲基汞的蓄积。水稻不同组织中总汞的变化规律与甲基汞一致。本次试验中，水稻体内甲基汞和总汞的蓄积量主要来源于暴露一周期间根系对甲基汞的吸收。在生长期内，水稻生物量随生育期推进而不断增加，外加生物稀释作用，使得水稻生育后期根系对甲基汞的吸收量较生育前期高，由此，水稻生育后期暴露组的甲基汞和总汞蓄积量显著高于生育前期暴露组。在实际的土壤-水稻体系中，甲基汞暴露存在于水稻整个生育期。此外，除了土壤外，大气汞也可以影响水稻体内汞的分配。研究表明植物能蓄积大气中的汞并主要贮存于地上组织[20]。因此有必要在实际稻田体系中验证上述结论，并进一步探讨大气汞对不同生育期水稻汞蓄积的贡献。

早期的研究表明，甲基汞在水稻体内的转运能力高于无机汞，稻米中有超过60%的汞是以甲基汞的形式存在[7−8]，本研究结果进一步证实了这一结论，即对水稻不同生育期进行甲基汞暴露，稻米中甲基汞占总汞的比例均超过60%。有研究显示，在水稻生育前期，水稻根系和茎叶组织均会发生甲基汞的去甲基化现象，且去甲基化作用属于水稻自身对于甲基汞毒性的防御机制，而与根表铁膜形成量等外界条件无关[17−18,21]。本研究发现水稻生育后期甲基汞暴露组，其秸秆和稻米中甲基汞占总汞的比例显著高于生育前期暴露组，表明水稻生育前期的甲基汞更容易发生转化，这导致甲基汞占总汞的比例更低。除了水稻体内可以发生甲基汞的转化外，光照也是引起水体内甲基汞降解的重要原因[22]。由于该试验中水稻生育中后期甲基汞暴露后剩余培养液中甲基汞的含量低于检测线，因此在生育中后期水稻体内发生的甲基汞的转化是否仍属于水稻甲基汞的转化抑或是由水稻体内、体外光降解或者其他因素共同作用引起的，仍有待于进一步的实验验证。

4 结论

（1）水稻生育后期进行甲基汞暴露，其体内甲基汞和总汞的蓄积量显著高于生育前期甲基汞暴露。不同生育期甲基汞暴露水稻体内甲基汞和总汞的含量表现为抽穗期组显著高于拔节期组、幼苗期组和分蘖期组。拔节期组水稻体内甲基汞和总汞含量显著高于幼苗期组和分蘖期组。

（2）甲基汞的转化与水稻生育期密切相关。水稻不同生育期甲基汞暴露，稻米中均有超过60%的汞是以甲基汞的形式存在。抽穗期组和拔节期组稻米甲基汞的比例显著高于幼苗期组和分蘖期组。

（3）水稻不同生育期进行甲基汞暴露，水稻各组织甲基汞的含量表现为：根部＞稻米＞秸秆。