清肝祛湿活血方对非酒精性脂肪肝大鼠ERK1/2 磷酸化的影响*

史晓伟，王一强，张玉香，姜德民，王凤丽，王干一，陈有源，王俊喹

( 1. 甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050; 2. 甘肃卫生职业学院，甘肃 兰州 730000； 3.兰州市安宁区医院，甘肃 兰州 730060； 4.西和县中医院，甘肃 西和 742100)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以肝脏中脂肪过度沉积和肝细胞脂肪变性为主要特征、且无过量饮酒史、排除其他肝特异性病因的临床常见疾病[1]，为肝细胞性肝硬化的重要病因[2]，发病率呈逐年上升趋势[3]，病情严重程度与越来越多的危险因素相关[4]。到目前为止，还没有一种针对NAFLD的治疗被证明是普遍有效的[5]。近年来，中医药在治疗NAFLD方面发挥了越来越重要的作用，具有多靶点治疗、安全可靠的特点，但作用机制尚不完全明确。本研究通过观察清肝祛湿活血方对NAFLD大鼠空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、游离脂肪酸(FFA)、三酰甘油(TG)、肝脏细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、肝脏固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)表达的影响，进一步阐明中药复方治疗NAFLD的部分机制、揭示作用靶点，完善中医药防治NAFLD的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

选取同批健康SPF级雄性SD大鼠90只，10周龄，体质量(150±20)g，购自甘肃中医药大学实验动物中心，生产许可证: SYXK(甘)2011-0001)。实验前适应性喂养1周，室温18～20 ℃，标准饲料喂养，自由进食，饮用自来水。

1.2 药品、试剂与仪器

清肝祛湿活血方处方组成：夏枯草10 g，密蒙花10 g，青葙子10 g，茵陈10 g，垂盆草10 g，丹参15 g，郁金10 g。中药煎剂由甘肃中医药大学药学实验室制备，诸药材由兰州方正医药有限公司提供。多烯磷脂酰胆碱(商品名：易善复)，由赛诺菲安万特北京制药有限公司提供，批号：090266。Rat Insulin ELISA试剂盒(批号E02I0004)和Rat P-ERK1/2 ELISA试剂盒(批号E02P0049)，购自上海蓝基生物科技有限公司；Phospho-SREBP 1c Antibody试剂盒(批号9874)，购自美国CST中国分公司产品；FFA ELISA试剂盒(批号TWp003228)和TG ELISA试剂盒(批号TWp028103)，购自上海通蔚实业有限公司。5417R低温高速离心机，德国EPPENDORF公司产品；BIO-TEK ELX800酶标仪，美国Bio-Rad公司产品；ELITE流式细胞仪，美国BECKMAN-COULTER公司产品。

1.3 动物分组与造模

将90只SD大鼠适应性喂养7 d后按照随机数字表法分为正常对照组，模型对照组，多烯磷脂酰胆碱组，清肝祛湿活血方低、中、高剂量组，各组15只。正常对照组予普通饲料喂养；其余各组根据文献[6]方法，予高脂饲料喂养+腹腔注射四环素造模。

造模成功后，清肝祛湿活血方低、中、高剂量组依次予清肝祛湿活血方生药5.63，11.25，22.5 g/(kg·d)灌胃，多烯磷脂酰胆碱组给予多烯磷脂酰胆碱550 μg/(g·d)，模型对照组和正常对照组予生理盐水 10 μL/(g·d)灌胃，连续给药 30 d。实验过程中观察、对比各组大鼠的一般情况。

1.4 检测指标

实验结束前大鼠空腹至少 8 h，经鼠尾静脉采血，使用博士血糖仪测定FPG。经眶后静脉丛采血，离心取上清，冻存，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测FINS、FFA和TG，并根据FPG及FINS计算出胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。HOMA-IR=胰岛素水平(μIU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。取肝脏组织，采用ELISA法测定肝脏ERK1/2，蛋白印记法检测肝脏SREBP-1c表达。操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5 统计学方法

2 结 果

实验结束时清肝祛湿活血方高剂量组死亡 2只大鼠，中剂量组死亡1只大鼠，解剖后发现是灌胃不当导致窒息而亡。

2.1 各组大鼠FPG、FINS和HOMA-IR对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠FPG、FINS和HOMA-IR均有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，清肝祛湿活血方各组FPG、FINS和HOMA-IR均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，多烯磷脂酰胆碱组无统计学意义(P>0.05)。与多烯磷脂酰胆碱组对比，清肝祛湿活血方3个剂量组FPG和FINS水平均明显下降， HOMA-IR改善明显，差别有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。说明清肝祛湿活血方能够显著改善NAFLD大鼠血糖代谢，胰岛功能及胰岛素抵抗。见表1。

组别动物数/只FPG/(mmol·L-1)FINS/(μIU·L-1)HOMA-IR正常对照组155.47±1.259.35±6.712.84±0.78模型对照组1513.07±3.43***46.85±13.28***23.75±5.61***多烯磷脂酰胆碱组1512.82±2.93#42.63±10.16#22.76±4.14#清肝祛湿活血方低剂量组159.75±1.55##△△30.24±8.64##△△13.63±2.85##△△清肝祛湿活血方中剂量组148.68±1.41##△△26.52±9.17##△△10.42±2.56##△△清肝祛湿活血方高剂量组137.52±1.24###△△△22.80±6.43###△△△7.38±1.44###△△△

注：与正常对照组对比，***P<0.01；与模型对照组对比，#P>0.05，##P<0.05，###P<0.01；与多烯磷脂酰胆碱组对比，△△P<0.05，△△△P<0.01

2.2 各组大鼠血清FFA、TG对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠血清FFA和TG均有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，多烯磷脂酰胆碱组和清肝祛湿活血方各组大鼠血清FFA和TG均明显下降，差别有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。与多烯磷脂酰胆碱组对比，清肝祛湿活血方低、中剂量组大鼠血清FFA和TG差别无统计学意义(P>0.05)，清肝祛湿活血方大剂量组有统计学意义(P<0.05)。说明清肝祛湿活血方能够改善NAFLD大鼠血脂代谢。见表2。

组 别动物数FFA/(μmol·L-1)TG/(mmol·L-1)正常对照组1562.24±4.561.21±0.08模型对照组15220.58±7.14***3.14±0.22***多烯磷脂酰胆碱组15125.32±5.71##1.82±0.17##清肝祛湿活血方低剂量组15136.82±5.13###△2.26±0.21##△清肝祛湿活血方中剂量组14117.36±4.92##△1.79±0.22##△清肝祛湿活血方高剂量组1387.42 ± 4.55###△△1.64±0.13###△△

注：与正常对照组对比，***P<0.01；与模型对照组对比，##P<0.05，###P<0.01；与多烯磷脂酰胆碱组对比，△P>0.05，△△P<0.05

2.3 各组大鼠肝脏组织ERK1/2、SREBP-1c表达对比

与正常对照组对比，模型对照组ERK1/2磷酸化增加，SREBP-1c表达升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，多烯磷脂酰胆碱组和清肝祛湿活血方各组ERK1/2和SREBP-1c下降，差别有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。与多烯磷脂酰胆碱组对比，清肝祛湿活血方低、中剂量组ERK1/2磷酸化和SREBP-1c表达无统计学意义(P>0.05)，清肝祛湿活血方大剂量组有统计学意义(P<0.05)。说明清肝祛湿活血方能够降低NAFLD大鼠肝脏内ERK1/2磷酸化，改善SREBP-1c过度表达。见表3。

组 别动物数ERK1/2/(μg· L-1)SREBP-1c/(mg·L-1)正常对照组154.16±0.580.38±0.06模型对照组156.12±0.84***1.24±0.23***多烯磷脂酰胆碱组155.48±0.53##0.76±0.13##清肝祛湿活血方低剂量组155.52±0.61##△0.72±0.10##△清肝祛湿活血方中剂量组145.10±0.49##△0.62±0.11##△清肝祛湿活血方高剂量组134.76±0.68###△△0.54±0.09###△△

注：与正常对照组对比，***P<0.01；与模型对照组对比，##P<0.05，###P<0.01；与多烯磷脂酰胆碱组对比，△P>0.05，△△P<0.05

3 讨 论

非酒精性脂肪肝属中医学“胁痛”“肝着”“积聚”“肝癖”等范畴。《非酒精性脂肪性肝病中医诊疗专家共识意见(2017)》[7]认为NAFLD或因饮食不节、或因情志失调、或因禀赋不足、或因劳逸失度、或因久病体虚而导致肝体阴用阳的功能失调、脾肾亏虚，痰、湿、浊、瘀、热等病理产物积聚而发病；病位在肝，涉及脾、肾等脏腑；临床推荐按照湿浊内停证、肝郁脾虚证、湿热蕴结证、痰瘀互结证、脾肾两虚证5个分型辨证论治。目前研究[8]认为，中药治疗NAFLD的主要作用机制为调节脂肪组织分泌和储存、改善胰岛素抵抗、调节氧化应激等。本课题组认为肝经湿热瘀阻为NAFLD的主要病机，依此病机自创清肝祛湿活血方，由夏枯草、垂盆草、郁金、茵陈、丹参、密蒙花、青葙子、炙甘草等组成。方中夏枯草、垂盆草、郁金清肝祛湿、活血化瘀，为君药；茵陈助垂盆草清利肝胆湿热，丹参助郁金凉血活血，为臣药；密蒙花、青葙子清肝凉血，为佐药。全方共奏清肝祛湿、活血化瘀之效。前期临床研究[9]表明：此方具有改善非酒精性脂肪肝患者临床症状，降低体重指数、腰围，改善肝功能和胰岛素抵抗，调节血脂代谢的作用；动物实验[10]发现其能够下调NAFLD大鼠肝脏固醇调节SREBP-1c表达。

西医学[11]认为二次打击学说是NAFLD的主要发病机制，其中游离脂肪酸和胰岛素抵抗是主要因素。SREBP-1c是主要表达于肝脏和脂肪细胞中的亚型，可调节三酰甘油和磷脂的合成、储存，其过度表达会调节靶基脂肪酸合酶合成增加。脂肪酸合酶是脂肪酸(FA)合成的关键酶，FA能抑制胰岛素受体底物胰岛素受体底物1的磷酸化，同时下调胰岛素受体底物2的转录水平，抑制胰岛素信号的正常转导而导致胰岛素抵抗[12-13]，形成NAFLD。ERK1/2可通过调节SREBP-1c转录因子的核成熟而刺激脂肪酸合酶的表达，且SREBP-1c的表达量随着ERK1/2磷酸化的增加而增多[14]。本研究显示，清肝祛湿活血方可有效减少SREBP-1c表达和细胞外信号ERK1/2磷酸化，降低NAFLD大鼠FFA、TG、FPG、FINS和HOMA-IR，改善胰岛素抵抗。由此表明，清肝祛湿活血方治疗非酒精性脂肪肝的部分机制是通过改善ERK1/2过度磷酸化，降低SREBP-1c表达，从而调节糖、脂代谢，改善胰岛素抵抗来实现的。本研究尚未开展清肝祛湿活血方对胰岛素信号转导通路影响干预的研究，是否是清肝祛湿活血方通过降低FA，从而影响胰岛素信号转导通路而致胰岛素抵抗还有待进一步研究。