顺铂、5-氟尿嘧啶与塞来昔布联合应用对胃癌细胞株SGC-7901凋亡行为的影响

翟崇宇，陈俊强*，王 震，黎伯培，毛远天

（广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530000）

胃癌（gastric carcinoma）是我国常见的恶性肿瘤，多发于年龄50岁以上的男性。据不完全统计，我国每年新发胃癌病例大约在42.7万，而每年死亡病例约30万[1]，现已成为我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。胃癌早期无明显症状，可存在轻微腹部不适，临床误诊和漏诊几率大。而大多数胃癌在确诊时已相对严重，导致无法单纯使用手术进行治疗。为此，如何寻找胃癌的侵袭转移机制，对于提高胃癌对化疗药物的敏感性以及临床效果非常重要。既往研究显示，环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和胃癌的侵袭转移过程有直接的关系。其诱导生成的前列腺素E2（PGE2）可在一定程度上与相关受体进行结合，从而促进Bcl-1基因的表达，达到抑制E-钙黏蛋白表达的目的，减少胃癌细胞的凋亡[2]。近期有研究显示，COX-2的选择性抑制剂塞来昔布可有效地抑制胃癌细胞中COX-2的表达同时可以在忆当年程度上抑制胃癌细胞的增殖和促进其凋亡[3]。基于此，本次研究通过细胞流式技术观察顺铂与5-氟尿嘧啶同塞来昔布联合应用对胃癌细胞株SGC-7901凋亡行为的影响，并探讨其可能涉及的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞材料

人胃癌细胞株SGC7901材料于中南大学湘雅细胞库采购。

1.2 仪器与材料

RPMI-1640培养液与标准胎牛血清（Gibco，USA）；青霉素-链霉素混合液（碧云天公司，中国上海）；顺铂（齐鲁制药有限公司，中国）；5-氟尿嘧啶及塞来昔布（Aladdin，USA）；细胞凋亡检测试剂盒（BD，USA）；二甲基亚砜（DMSO）（Solarbio，USA）；PBS磷酸盐缓冲液（干粉）（索莱宝科技有限公司，中国北京）；CO2细胞培养箱（Thermo Forma，USA）；超净工作台（苏州净化设备有限公司，中国）；细胞培养瓶及吸管（Corning，USA）；电热恒温水浴箱（上海医疗器械厂，中国）；流式细胞仪（BD，USA）。

1.3 方法

1.3.1 胃癌细胞SGC-7901的培养及药物处理

（1）将冷冻储存的胃癌细胞株SGC-7901，在1分钟内予以溶解，将胃癌细胞株SGC-7901溶解悬液置入培养基之中，并吹匀，以800 rpm进行离心处理，时间约为3分钟。

（2）保留胃癌细胞株SGC-7901悬液沉淀，应用培养基再次制备成为悬液，同时根据胃癌细胞的具体状态，将5滴细胞悬液与4 ml培养基进行水平十字混合，保持37℃之中培养24小时。

（3）用1×PBS清洗细胞后更换培养基，混入约6 ml新鲜的细胞培养基，一般每24～48 h更换一次。

（4）采用电子显微镜观察胃癌细胞株SGC-7901，如胃癌细胞占屏80%以上后，进行传代。

（5）细胞悬液混合新培养基进一步培养。

（6）观察细胞生长状态，待细胞生长状态良好后，将其分为五个实验组（参照组、顺铂组、5-氟尿嘧啶组、顺铂+塞来昔布组、5-氟尿嘧啶+塞来昔布组），同时建立6个药物浓度梯度[4,5]对各组细胞分别进行的药物作用处理。找到顺铂组、5-氟尿嘧啶组及塞来昔布组的半数抑制浓度分别为10.43±0.27 mg/L、156.56±2.07 mg/L、92.04±4.93 umol/L。

1.3.2 流式细胞技术检测不同药物治疗模式下胃癌细胞株SGC-7901凋亡情况

将各组经半数抑制浓度作用24 h后的胃癌细胞株SGC-7901采用0.25%的胰酶进行消化，检测中可在消化时混入2%牛血清白蛋白，避免消化过度而导致检测结果存在偏差。在标记前用1×缓冲液清洗胃癌细胞，去除细胞中的牛血清白蛋白，保证检测结果准确性。

a.将贴于培养皿壁的胃癌细胞取下，于室温条件下进行离心处理，转速：2000 rpm时间：5～10分钟；

b.再次用1×缓冲液清洗胃癌细胞，于室温条件下进行离心处理，转速：2000 rpm时间：5～10分钟；

c.将300 μl1×缓冲液与细胞混合；

d.采用5 μlAnnexin V-FITC试剂与细胞悬液充分混合，室温下静置15～20分钟（需予以避光处理）；

e.应用200 μl1×缓冲液与细胞悬液充分混合；

f.将5 μlPI制剂与细胞悬液充分混合，予以检测。

1.4 统计学处理

数据纳入SPSS 22.0统计软件分析，计数资料采用x2检验，采用例数（n）百分数（%）表示，计量资料行t检验，以“±s”表示，以P＜0.05差异有统计学意义。

2 结 果

参照组、顺铂组、5-氟尿嘧啶组、顺铂+塞来昔布组、5-氟尿嘧啶+塞来昔布组胃癌细胞株SGC-7901凋亡率分别为（7.10±0.30）%、（46.53±1.50）%、（39.17±1.10）%、（66.93±0.70）%、（62.13±1.60）%；与参照组相比，各组凋亡率明显增加（P＜0.05），且顺铂+塞来昔布组、5-氟尿嘧啶+塞来昔布组与顺铂组、5-氟尿嘧啶组相比，细胞凋亡率明显增殖（P＜0.05）。（表1、图1、图2）

表1 各组细胞加入半数抑制浓度药物后SGC7901细胞凋亡情况

图1 流式细胞术检测细胞株SCG-7901各实验组经药物作用48小时后细胞凋亡率情况

图2 流式细胞术检测细胞株SCG-7901各实验组经药物作用48小时后细胞凋亡率情况

3 讨 论

顺铂和5-氟尿嘧啶药品是临床常用化疗药物，前者通过和肿瘤细胞中DNA结合，形成交叉键，进而对DNA复制行为起到了破坏作用。5-氟尿嘧啶药物的胃癌细胞凋亡机制是通过药物抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，从而使胃癌细胞DNA的合成行为受到抑制，促使胃癌细胞逐渐凋亡。但是，在临床治疗过程中，患者极易出现耐药问题，致使胃癌患者化疗效果难以保障，严重时甚至会造成患者化疗失败，严重威胁患者生命安全[6,7]。因此，应进一步研究胃癌临床化疗药物对胃癌细胞的凋亡行为，以便于保证患者化疗效果。塞来昔布药物作为一种非特异性环氧化酶抑制剂，具有抗炎、解热或镇痛等临床作用，也成为胃癌患者临床治疗的药剂。

近年来，研究非特异性环氧化酶抑制剂在胃癌临床治疗中的研究成果较少，尤其是与化疗药物相互联合应用方面。Tendo M、Yashiro M等人[8]采用胃癌腹膜转移裸鼠模型化疗药物与非特异性环氧化酶抑制剂作用的影响，其结果显示经口予非特异性环氧化酶抑制剂JTE-522与S-1联合应用于胃癌腹膜转移治疗效果较好，说明非特异性环氧化酶抑制剂与S-1联合应用模式具有临床治疗胃癌腹膜转移的价值。Chen M、Yu L等人[9]研究结果表明，非特异性环氧化酶抑制剂能够避免胃癌患者顺铂发生耐药反应，但是在裸鼠移植瘤模型研究结果中显示，塞来昔布和顺铂联合模式的胃癌细胞株SGC-7901凋亡效果并未予以凸显。鉴于此，究竟化疗药与COX-2抑制剂联合应用能否提高胃癌的化疗效果目前仍存在争议。塞来昔布作为非特异性环氧化酶抑制剂的代表性药物，其抗胃癌效果较为明显。本研究结果显示，与顺铂组、5-氟尿嘧啶组相比，顺铂+塞来昔布组、5-氟尿嘧啶+塞来昔布组治疗效果较好，药物在联合作用后能够促进胃癌细胞株SGC-7901凋亡行为，抑制细胞增殖，增强药物敏感性。

综上所述，顺铂、5-氟尿嘧啶联合塞来昔布用药相较于单一用药可以进一步促进胃癌细胞凋亡，但是否与P53、蛋白激酶A、AKT、Fas、Bcl-2/Bax、Bak、caspase-9等蛋白的表达调节及相关通路有关需进一步研究。