S-烯丙基巯基半胱氨酸对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响

周琪，张海萍，牛凤玲，林婷，闫金银

(河北省唐山市人民医院，河北唐山063000)

乳腺癌发病人数大约占全球女性癌症发病人数的23%，并成为女性癌症死因之首，且其发病率呈逐年上升趋势[1]。化疗是乳腺癌全身治疗中不可或缺的治疗手段，给患者带来了很大的生存获益。研究[2～7]表明，大蒜的活性成分具有抗菌消炎、降血脂、预防心血管疾病、提高免疫力、抗氧化、神经元保护、延缓衰老、防治肿瘤等多方面的功效[8～11]。S-烯丙基巯基半胱氨酸(SAMC)是大蒜素复杂混合物中的主要活性成分之一，因其化学性质稳定、生物利用度高而备受关注[12～14]。SAMC对多种恶性肿瘤(如大肠癌、膀胱癌、肾癌、骨肿瘤)体内、体外的增殖均有抑制作用，但对乳腺癌细胞的作用相关研究相对较少。因此，本研究观察了SAMC对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响，探讨SAMC体外抗乳腺癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 MCF-7乳腺癌细胞购自百恩维生物科技有限公司，为低侵袭性乳腺癌细胞(ER、PR均为阳性，HER-2为阴性)。SAMC试剂购自北京世纪奥科生物技术有限公司。培养乳腺癌细胞的DMEM培养基及胎牛血清等试剂均购自Sigma公司。

1.2 细胞培养及SAMC用法 MCF-7细胞培养于完全培养基中，每2 d更换1次培养液，待对数生长期细胞大约长满培养瓶底部面积的80%时，用0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化、传代，并以1×105/mL的量接种在50 mL的培养瓶中继续培养，以备后续实验应用。将细胞分为4个组，分别加入浓度为0、25、50、100 μmol/L的SAMC。

1.3 细胞增殖能力检测 取对数生长期的MCF-7细胞，调整细胞浓度浓度为1×104/mL接种于96孔板，按“1.2”方法加入不同浓度的SAMC，于给药后24、48、72 h每孔加入20 μL的MTT溶液。培养结束后弃掉上清液，每孔分别加入100 μL的二甲基亚砜，震荡10 min。用酶标仪在570 nm处测定各个孔的吸光度值(OD值)，以0 μmol/L SAMC组作为对照组，计算细胞增殖率：(1-实验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.4 细胞凋亡率测算 选取处于对数生长期的MCF-7细胞，调整细胞浓度为5×105/mL并接种于6孔板。按“1.2”方法分别加入不同浓度的SAMC，分别于给药24、48、72 h后在5% CO2、37 ℃条件下培养24 h，离心，离心后的细胞悬液应用PBS洗涤3次，之后滴加碘化丙啶，避光环境下染色15 min，流式细胞仪检测凋亡细胞，并计算细胞凋亡率。

2 结果

2.1 各组细胞增殖率比较 同一浓度组内，给药24、48、72 h后MCF-7细胞增殖率依次下降(P均<0.01)；相同培养时间下，0 μmol/L组、25 μmol/L组、50 μmol/L组、100 μmol/L组细胞增殖率依次下降(P均<0.01)。见表1。相关性分析结果显示，给药24、48、72 h后MCF-7细胞增殖率与SAMC浓度呈负相关(r分别为-0.17、-0.35、-0.71，P均<0.05)。

表1 不同给药时间各组细胞增殖率比较

2.2 各组细胞凋亡率比较 同一浓度组内，给药后24、48、72 h后MCF-7细胞凋亡率依次增高(P均<0.01)；相同培养时间下，0 μmol/L组、25 μmol/L组、50 μmol/L组、100 μmol/L组细胞凋亡率依次增高(P均<0.01)。详见表2。相关性分析结果显示，MCF-7细胞凋亡率与SAMC浓度呈正相关(r=0.27，P<0.05)。

表2 不同给药时间各组细胞凋亡率比较

3 讨论

新鲜大蒜含有多种成分，但主要活性物质为蒜氨酸、蒜酶及蒜氨酸-蒜酶反应系统产生的含硫化合物。大蒜被加工或物理机械压碎后，蒜氨酸会在蒜酶的催化下产生蒜素，蒜素极不稳定，可进一步转变为一些有机硫化物混合物，这些硫化物(DAS、DADS、DATS、DATTS)具有很强的抗氧化作用，可通过清除体内过多的氧自由基等物质，起到维持细胞膜稳定、保护细胞结构完整的作用。在抗肿瘤方面，大蒜提取物可通过调节致癌物代谢、阻滞肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡、抗氧化和提高机体免疫力等途径抑制动物体内的肿瘤生长，同时，联合应用还能提高化疗药物的治疗效果[15～18]。

多项研究[19,20]证实大蒜提取物可有效的抑制乳腺癌细胞的生长。Li等[10]使用不同浓度的DATS干预乳腺癌细胞系MCF-7和SUM159，并采用Western blotting法检测PCNA、Cyclin D1、Bcl-2及Bax蛋白，结果显示，随着DATS浓度的增加，PCNA、Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达逐渐减小，Bax蛋白表达逐渐增加，间接证明，DATS可抑制乳腺癌细胞增殖，并促进其凋亡。

体外实验中蒜素能够比较稳定地发挥其抗肿瘤作用，而在动物体内实验或在临床试验中，却很难得到完美的大蒜素抗癌作用的证据[21～23]。深入研究发现其主要原因是蒜素的活性成分为有机硫化物混合物，这些硫化物化学性质不稳定，自然条件下容易分解。体外实验时，药物能迅速发挥抗癌作用，但当药物进入体内后可能很快被代谢、清除，从而很难发挥应有作用。

SAMC是蒜素的主要水溶性活性成分之一，无刺激性气味，化学性质稳定。SAMC对很多恶性肿瘤如消化系统肿瘤、膀胱癌、甲状腺癌等体内、体外的增殖均可发挥抑制作用。在体内实验中，Kim等[24]发现SAMC可通过影响PKA信号转导途径预防膀胱癌的发生。有学者[25]使用人胃癌SGC-7901细胞皮下接种的方式建立裸鼠胃癌移植瘤模型，SAMC治疗30 d后，脱颈处死小鼠，取瘤体行TUNEL染色，发现SAMC治疗组肿瘤的凋亡指数远高于对照组，进一步研究显示，SAMC可能是通过MAPK和PI3K/Akt信号通路对肿瘤生长产生影响。

本研究观察了SAMC对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响，结果显示，同一浓度组内，给药后24、48、72 h后MCF-7细胞增殖率依次下降；相同培养时间下，0 μmol/L组、25 μmol/L组、50 μmol/L组、100 μmol/L组细胞增殖率依次下降；给药24、48、72 h后MCF-7细胞增殖率与SAMC浓度呈负相关。而且，同一浓度组内，给药后24、48、72 h后MCF-7细胞凋亡率依次增高；相同培养时间下，0 μmol/L组、25 μmol/L组、50 μmol/L组、100 μmol/L组细胞凋亡率依次增高；MCF-7细胞凋亡率与SAMC浓度呈正相关。上述研究结果表明MCF-7细胞的增殖速率随着SAMC浓度的提高、干预时间的延长而下降，细胞凋亡率则随着SAMC的浓度升高而增高，提示SAMC可以显著抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖，并促进细胞凋亡，作用与浓度呈一定相关性。值得一提的是，由于本实验为体外实验，未对体内研究进行验证，故结果具有一定的局限性。鉴于SAMC的优势主要体现在体内模型中，接下来仍需进一步做动物体内实验进行抗乳腺癌作用的验证。