雷帕霉素对甲状腺癌细胞株K1的增殖、迁移能力影响及其机制

赵永魁，王晓涛，陈建立，王长友，张国志

(华北理工大学附属医院，河北唐山063000)

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，其中甲状腺乳头状癌是最常见的一种类型，约占80%。近年来我国甲状腺癌发病率持续上升，是增长速度最快的恶性肿瘤[1]。目前针对分化较好、无淋巴结转移的甲状腺癌，主要是通过手术联合131I放疗及内分泌治疗，可获得较好的预后[2]。然而对已发生131I耐受或远处转移的乳头状癌、未分化癌和髓样癌来说，传统治疗效果不佳[3]。同时手术治疗可能存在神经副损伤及术后瘢痕影响美观等不足。因此，甲状腺癌药物治疗相关研究具有较大的临床意义及前景。甲状腺癌的发病机制尚不明确，有研究表明与细胞自噬有关[4]。自噬是细胞利用自噬-溶酶体系统对受损或坏死细胞器进行水解，将分解所得到的产物供细胞再利用的过程。自噬对细胞生长发育、维持内环境稳定具有重要意义，同时也与疾病的发生有关[5]。大量文献[6]表明，自噬功能障碍与肿瘤细胞的发生、发展密切相关。雷帕霉素是一种真核生物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂，可通过抑制mTOR诱发自噬而发挥抗肿瘤作用[7]。3-甲基腺嘌呤(3-MA)作为自噬经典抑制剂，可通过对PI3K的作用影响自噬体形成，阻断自噬[8]。本研究观察了雷帕霉素作用后人甲状腺乳头状癌K1细胞增殖、迁移能力变化，并观察了自噬相关蛋白LC3、p62的表达情况，为阐明自噬与甲状腺癌的关系及雷帕霉素在甲状腺癌治疗中的运用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 甲状腺乳头状癌K1细胞购自中国科学院干细胞库。RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司。雷帕霉素、3-MA购自北京索莱宝公司。兔抗人p62抗体、LC3抗体购自美国Abcam公司。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗、GAPDH抗体、MTT细胞增殖毒性检测试剂盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度检测试剂盒、电化学发光免疫分析仪(ECL)均购自上海碧云天生物技术研究所。酶标仪、湿转系统购自上海Bio-Rad公司。12孔Transwell小室购自北京索莱宝公司。

1.2 雷帕霉素溶液、3-MA溶液的配制及适宜作用浓度筛选 ①雷帕霉素溶液配制：按说明书用二甲基亚砜(DMSO)将雷帕霉素配制成浓度为100 mmol/L的溶液，使用前用不含FBS的培养基RPMI1640稀释成浓度为100 μmol/L的溶液。②3-MA溶液配制：按说明书用DMSO将3-MA溶解，配制成浓度为200 mmol/L的溶液备用。③雷帕霉素适宜作用浓度筛选：K1细胞用含10% FBS的RPMI1640培养基在37℃、5% CO2恒温箱中培养；取生长状态良好的细胞用0.25%胰酶消化制成1×105/mL的细胞悬液，每孔加入100 μL接种于96孔板，分为A、B、C、D、E、F组，每组设4个复孔；24 h后更换培养基，A组加入100 μL的培养基，B组加入99 μL培养基+1 μL雷帕霉素，C组加入95 μL培养基+5 μL雷帕霉素，D组加入90 μL培养基+10 μL雷帕霉素，E组加入85 μL培养基+15 μL雷帕霉素，F组加入80 μL培养基+20 μL雷帕霉素；培养24 h后每孔加入10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，继续在培养箱中反应4 h，弃培养基，每孔加入100 μL的DMSO，置于培养箱中反应15 min，应用酶标仪在570 nm波长处测定各孔的吸光度值(OD值)。结果显示不同浓度雷帕霉素对K1细胞增殖均有抑制作用，且随着雷帕霉素浓度升高，细胞存活率逐渐降低。以时间为横轴、以细胞存活率为纵轴绘制细胞存活曲线。利用存活曲线得出雷帕霉素半抑制浓度(IC50)为10 μmol/L，以此作为实验浓度。为保证3-MA对细胞无毒性作用，要求3-MA终浓度为1 mmol/L。

1.3 细胞分组及处理 取生长状态良好的K1细胞用0.25%胰酶消化制成密度为1×105/mL的细胞悬液，每孔取2 mL细胞悬液接种于3个6孔板，继续培养，待细胞密度达80%开始实验。将K1细胞分为对照组、雷帕霉素组、雷帕霉素+3-MA组。对照组不做任何处理，加入2 mL培养基；雷帕霉素组加入100 μmol/L雷帕霉素0.2 mL及培养基1.8 mL；雷帕霉素+3-MA组先加入100 μmol/L雷帕霉素200 μL及培养基1.79 mL，1 h后加入1 mmol/L 3-MA溶液10 uL。上述各组细胞继续置于恒温箱中培养24 h。

1.4 各组细胞增殖能力检测 采用MTT法。取各组生长状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化制成密度为1×105/mL的细胞悬液，每孔加入100 μL接种于4个96孔板，每组取4个复孔。置于恒温箱中培养，分别于24、48、72、96 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，继续在培养箱中反应4 h，弃培养基，每孔加入DMSO 100 μL，置于培养箱中反应15 min，用酶标仪在570 nm波长处测定各孔的OD值，代表细胞增殖能力。

1.5 各组细胞迁移能力检测 采用Transwell法。取各组生长状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化，用不含FBS培养基稀释成密度为2×106/mL的细胞悬液。取100 μL的细胞悬液加入Transwell上室内，下室加入高浓度FBS(20%)培养基800 mL，置恒温箱中培养。24 h后取出小室，用小刀将膜取下，穿过细胞膜的细胞细胞用HE染色。100倍显微镜下随机挑选5个视野，计数穿膜细胞数。

1.6 各组细胞中LC3、p62蛋白检测 采用Western blotting法。提取各组细胞细胞蛋白经定量、变性后于-80 ℃冰箱保存备用。按试剂盒说明配制12%分离胶、6%浓缩胶，蛋白上样量40 μg，90 V恒压电泳1 h，采用恒压湿转(p62蛋白为90 V、60 min，LC3蛋白为90 V、20 min)。配制10%脱脂牛奶，将膜置于10%脱脂牛奶中摇床封闭2 h，加入一抗(1∶1 000)4 ℃摇床孵育过夜，TBST溶液洗膜3次、每次10 min，加入二抗(1∶1 000)室温 2 h，TBST溶液洗膜3次、每次10 min，ECL荧光显色。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值。以目的蛋白灰度值与内参GAPDH蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 培养48、72、96 h后，雷帕霉素组细胞增殖能力低于对照组，雷帕霉素+3-MA组细胞增殖能力高于雷帕霉素组(P均<0.01)。详见表1。

表1 各组细胞OD值比较

注：与对照组相比，*P<0.01；与雷帕霉素组相比，#P<0.01。

2.2 各组细胞侵袭能力比较 对照组、雷帕霉素组、雷帕霉素+3-MA组穿膜细胞数为分别为(310.4±5.7)、(100.4±4.5)、(292.2±4.6)个/视野，雷帕霉素组穿膜细胞数少于对照组，雷帕霉素+3-MA组穿膜细胞数多于雷帕霉素组(P均<0.01)。见图1。

图1 各组穿膜细胞情况

2.3 各组细胞中p62、LC3蛋白表达比较 对照组、雷帕霉素组及雷帕霉素+3-MA组中p62蛋白相对表达量分别为1.215±0.106、0.232±0.025、0.876±0.054，LC3蛋白相对表达量分别为0.091±0.012、1.980±0.095、0.363±0.058。雷帕霉素组LC3蛋白相对表达量高于对照组，p62蛋白相对表达量低于对照组(P均<0.01)；雷帕霉素+3MA组LC3蛋白相对表达量低于雷帕霉素组，p62蛋白相对表达量高于雷帕霉素组(P均<0.01)。见图2。

图2 各组细胞中LC3、p62蛋白电泳条带

3 讨论

甲状腺癌是临床上常见的恶性肿瘤，以女性多见，男女发病比例1∶3。有研究[4]表明甲状腺癌的发病与细胞自噬有关。细胞自噬功能近年来受到了较多关注。自噬通过去除功能失调或受损的细胞成分并回收必需的细胞成分，在稳态的维持中发挥重要作用[10]。自噬功能障碍与肿瘤细胞的发生、发展密不可分[6]。自噬在恶性肿瘤发生发展中呈现双重作用：在高度侵袭性恶性肿瘤中，仅通过血管生成和有氧糖酵解是无法满足恶性肿瘤的高代谢，因此需激活替代代谢途径，通过自噬被循环以提供细胞能量来源[11]；然而，随着细胞成分逐渐消耗，无限制的自噬最终导致细胞死亡[12]。因此，自噬既可以维持肿瘤细胞的生长和发展，也可以因自噬作用过度引起“自噬性死亡”从而抑制肿瘤细胞生长[13,14]。

雷帕霉素是真核生物mTOR最常见的抑制剂。mTOR是调节细胞生长和周期的关键蛋白，可通过磷酸化核糖体激酶S6K和真核生物起始因子4E-BP1从而促进细胞生长。当mTORC1活性被抑制后，下游分子4E-BP1和S6K被抑制，cyclin D1、HIF-1活性降低，抑制细胞周期、细胞生长和新血管生成[15]。Liu等[16]发现雷帕霉素可对骨肉瘤细胞生长产生抑制作用。研究[17]表明，在很多肿瘤细胞中存在编码mTOR蛋白基因突变，使肿瘤细胞中mTOR过度表达。在甲状腺癌细胞的生长、增殖过程中，PI3K-AKT-mTOR信号通路发挥重要作用[18]。本研究结果显示，培养48、72、96 h后，雷帕霉素组细胞增殖能力低于对照组，雷帕霉素+3-MA组细胞增殖能力高于雷帕霉素组；雷帕霉素组穿膜细胞数少于对照组，雷帕霉素+3-MA组穿膜细胞数多于雷帕霉素组。上述结果表明雷帕霉素对甲状腺癌细胞的增殖、迁移能力有抑制作用。有报道[19]称，mTOR具有抑制自噬等功能。Eum等[20]研究发现雷帕霉素发挥抗肿瘤作用是通过抑制mTOR诱发自噬来完成的。因此推测雷帕霉素对K1细胞增殖、迁移能力的抑制作用可能与自噬有关。

3-MA是自噬经典抑制剂[8]。在实验过程中，我们发现加入3-MA后细胞增殖能力及迁移能力均较雷帕霉素组明显增强，进一步提示雷帕霉素抑制K1细胞增殖、迁移能力与自噬有关。在涉及自噬过程的各种蛋白中，LC3参与延伸并促成自噬体形成[11]；p62是一种自噬特异性底物，可将泛素化蛋白转移至自噬体[21]，其蛋白序列上有一特殊区域能够被LC3识别，其与LC3相互作用不断被自噬-溶酶体系统降解[22]。因此LC3、p62是目前观察自噬现象是否存在较为可靠的生物学标志物。我们进一步检测了各组细胞中自噬相关蛋白的表达情况，发现雷帕霉素组LC3蛋白相对表达量高于对照组，p62蛋白相对表达量低于对照组；雷帕霉素+3-MA组LC3蛋白相对表达量低于雷帕霉素组，p62蛋白相对表达量高于雷帕霉素组。上述结果提示雷帕霉素作用后细胞自噬增强，而加入自噬抑制剂后细胞自噬被抑制，进一步验证了上述结论。

综上所述，雷帕霉素作用后甲状腺乳头状癌细胞的增殖、迁移能力受到抑制，其机制可能与诱发自噬有关，具体机制有待进一步研究证实。