8株产NDM-1肠杆菌科细菌的耐药特点和流行性分析

张 盼，沈振华，张燕华，刘兴晖，李向阳

（1. 上海市浦东新区公利医院检验科，上海 200135；2. 温州医科大学附属第二医院 育英儿童医院检验科，浙江 温州 325000）

碳青霉烯类抗菌药物具有较广的抗菌谱和较强的抗菌活性，已经成为治疗细菌感染，尤其是产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum betalactamase，ESBL）和头孢菌素酶（AmpC β-内酰胺酶）细菌的首选药物[1]。但随着人们对抗菌药物的过度使用，各种耐药的“超级细菌”不断出现并成为一个日益严重的世界性公共卫生问题。2009年，Yong等在1例印度裔瑞典尿路感染患者体内检出产新德里金属β-内酰胺酶1（New Delhi metallo-β-lactamase 1，NDM-1）的肺炎克雷伯菌[2]，随后该菌向欧洲各国家蔓延。目前，中国、英国、美国、法国、日本、德国、澳大利亚等多个国家均有产NDM-1细菌感染的报道。NDM-1是一种新型B类β-内酰胺酶，能够水解碳青霉烯类抗菌药物，目前由于缺乏更为高效的抗菌药物，给临床治疗带来极大困难，造成严重的危害。NDM-1在我国是从革兰阳性菌中被首次检测出来的[3]，且最初多检出于鲍曼不动杆菌，而目前也有不少从肠杆菌科细菌中检出NDM-1的报道，但各个地区耐药菌株的流行情况不明确。为此，本研究拟对8株产NDM-1菌株进行耐药性、分子生物学特点分析。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集2013年1—12月温州医科大学附属第二医院临床分离的非重复碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌67株。药物敏感性试验质控菌株为铜绿假单胞菌（ATCC 27853），改良Hodge试验阴性对照菌为肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）。接合转移受体菌为大肠埃希菌J53，脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）分型标准相对分子质量菌株为沙门菌H9812。

1.2 仪器与试剂

Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统及配套GN鉴定卡和GN13药物敏感性试验卡（法国生物梅里埃公司），S100 Thermal Cycler PCR仪（美国伯乐公司），Power Pac Basic 稳压稳流电泳仪（美国伯乐公司），Gel Doc XR型凝胶成像分析仪（美国伯乐公司），CHEF-Mapper XA PFGE系统（美国伯乐公司）等；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增引物由上海桑尼生物有限公司合成。PCR反应试剂、100 bp DNA Marker（日本Takara公司），琼脂糖凝胶干粉（法国Biowest公司）；XbaⅠ限制性内切酶（日本Takara公司），蛋白酶K（德国Roche生物公司），PFGE 低熔点琼脂糖凝胶干粉（美国伯乐公司），SeaKem Gold Agarose（美国Lonza公司）等。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定和体外药物敏感性试验 采用Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统进行菌株鉴定和体外药物敏感性试验，药物敏感性试验结果按照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2013年的标准[4]进行判断。

1.2.2 改良Hodge试验 参照CLSI的方法操作，被测菌株与大肠埃希菌（ATCC 25922）抑菌圈交汇处大肠埃希菌生长增强即为阳性。

1.2.3 耐药基因的检测 采用BioFlux细菌全基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组总DNA，PCR扩增碳青霉烯酶基因blaNDM-1[5]、ESBL基因和ampC基因。扩增产物经含溴化乙锭（ethidium bromide，EB）的1.5 %琼脂糖凝胶110 V电泳30 min，在凝胶成像分析系统上观察并记录结果。阳性扩增产物送上海桑尼生物有限公司测序，在美国国立生物技术信息中心网站上进行Blast比对分析。

1.2.4 接合转移试验 叠氮钠耐药的受体菌大肠埃希菌J53与试验菌株经LB肉汤培养接合后，用含抗菌药物（1 μg/mL亚胺培南和200 μg/mL叠氮钠）的复合水解酪蛋白胨平板筛选接合子。对疑似接合子进行生化、药物敏感性试验和NDM-1基因扩增试验以证实接合子。

1.2.5 PFGE菌株同源性分析 2 %的低熔点胶包埋细菌基因组DNA，经溶菌酶、蛋白酶K裂解消化，37 ℃ XbaⅠ酶切14 h。于PFGE电泳槽内电泳18～22 h。经EB染色后在成像仪中观察结果。

2 结果

2.1 菌株分布

在67株肠杆菌科细菌中共检出8株携带NDM-1基因的菌株，其中肺炎克雷伯菌2株、阴沟肠杆菌3株、弗氏柠檬酸杆菌1株、大肠埃希菌2株。

2.2 患者病例资料

8株菌株分别分离自8例患者，其中5株来自儿童，3株来自成人，科室来源较为广泛，无明显聚集性。对这8例患者进行回顾性分析发现，有6例同时伴有其他菌株的混合感染，6例患者在菌株检出前均单独或联合使用过多种抗菌药物进行预防或抗感染治疗。8例患者的具体诊断、治疗情况见表1。

2.3 体外药物敏感性试验

8株菌株对头孢菌素类、单环内酰胺类、β-内酰胺酶抑制剂复合物和呋喃妥因等抗菌药物均表现出较高的耐药性，但对氨基糖苷类（阿米卡星、庆大霉素）和氟喹诺酮类（左氧氟沙星）药物的敏感性较好。见表2。

2.4 改良Hodge试验及耐药基因的检测

8株菌株中有7株改良Hodge试验阳性，另外1株肺炎克雷伯菌为阴性。8株菌株中有5株携带SHV基因、2株携带CTX-M-1基因、1株携带DHA-1基因。各菌株多同时携带2种及以上的耐药基因。测序结果显示，所有NDM-1阳性扩增序列与NDM-1（GenBank：FN396876.1）同源性为100%。耐药基因检出结果见表3，PCR扩增产物电泳结果见图1。

表1 8例患者的诊断和治疗情况

表2 8株菌株抗菌药物敏感性试验结果

2.5 接合转移试验

6株产NDM-1菌株（2株大肠埃希菌除外）与大肠埃希菌J53接合成功。阳性接合子对β-内酰胺类药物的耐药性较高，但对氨基糖苷类、氟喹诺酮类、复方磺胺甲噁唑和呋喃妥因几乎全部敏感。

2.6 PFGE同源性分析

2株大肠埃希菌无同源性，3株阴沟肠杆菌中3号与4号菌株PFGE谱带相同，可视为同一克隆株。见图2。

表3 菌株表型和耐药基因携带情况

图1 8株产NDM-1 菌株PCR阳性扩增产物电泳图

图2 2株大肠埃希菌和3株阴沟肠杆菌PFGE电泳图

3 讨论

blaNDM-1于2009年被首次报道，先后从分离自同一例患者尿液样本的肺炎克雷伯菌和粪便样本分离的大肠埃希菌中检测出[2]。有研究结果显示，blaNDM-1位于大小不同的可转移质粒上，编码NDM-1酶的blaNDM-1基因包含813 bp的开放读码框，GC含量为57%，低于周围相邻基因片段GC含量（62%～65%），所以推测blaNDM-1基因片段属于外源转移获得的新DNA片段，该基因进入细菌基因组并发生了重组[2，6-7]。这种方式给耐药基因的传播提供了基础，从而增加了耐药基因传播的概率，也促进了耐药菌株的变异。在此基因片段的上游还检测到其他多种耐药基因，如抗利福平、氯霉素、链霉素、磺胺类等，使得携带此类质粒的细菌对除多黏菌素和替加环素外的几乎所有抗菌药物耐药。本研究中的菌株对β-内酰胺类药物及β-内酰胺酶抑制剂复合物均表现出较高的耐药性，而对氨基糖苷类和氟喹诺酮类药物敏感性较好，因此可根据药物敏感性试验结果选择临床抗感染的主要治疗药物。本研究通过对耐药基因的检测发现，各菌株多携带多种耐药基因，这也是细菌对多种β-内酰胺类药物耐药的一个原因。试验菌株可通过接合转移试验将耐药基因转移到受体菌中，证明了blaNDM-1基因的可转移性，而阳性接合子对β-内酰胺类药物的耐药性较高，但对氨基糖苷类、氟喹诺酮类、复方磺胺甲噁唑和呋喃妥因几乎全部敏感。PFGE结果分析发现，2株大肠埃希菌没有同源性，而3株阴沟肠杆菌中有2株谱带相同，视为同一克隆株，但与另外1株属于不同克隆株，这反映出本研究的菌株既存在耐药基因在不同菌株间的水平传播，也存在同一菌株在不同患者间的克隆传播，提示临床需加强病区卫生消毒管理，提高医护人员的卫生防范意识。

在病原菌与抗菌药物的相互斗争中，耐药菌株不断被筛选出来，新的耐药基因不断被发现。本研究从多种肠杆菌科细菌中检出blaNDM-1基因，而本实验室先前的研究中仅检测出blaKPC及blaIMP基因[8]，说明菌株的耐药表型、耐药基因型及流行分布情况等会因时间、地区等的差异而有所不同。改良Hodge试验是CLSI推荐的碳青霉烯酶表型确证试验，仅适用于肠杆菌科细菌，对于伴随孔蛋白丢失，产ESBL或AmpC β-内酰胺酶的菌株会出现假阳性结果，偶尔会出现假阴性，尤其是产金属酶菌株。本研究中1株肺炎克雷伯菌改良Hodge试验为阴性，可以通过联合乙二胺四乙酸-双纸片协同试验或进行Carba NP 试验，提高对金属酶检出的敏感性。本研究的8株菌株中，有5株分离自儿童，3株分离自成人，这些患者大多具有严重的基础疾病及并发症，接受过外科手术及一些侵入性操作，在耐药菌检出前单独或联合使用过多种抗菌药物进行预防或抗感染治疗，这些均是导致耐药菌株感染的高危因素。

目前，国内也有产NDM-1细菌感染的报道，但不同地区有所差异，我国首次报道是在2010年，宁夏和福建分别发现了2株携带该耐药基因的屎肠球菌和1株鲍曼不动杆菌[3，9]。继而海南、福建、浙江、云南、江西、河北等地均有耐药菌株的出现[10-14]。HO等[15]在2011年对18个省57家医院的11 298株肠杆菌blaNDM-1抗性基因的流行情况进行调查，结果显示我国具有不同的抗性菌株和携带质粒的流行现象。相关的研究中携带blaNDM-1基因进行传播的质粒有IncL/M、IncA/C、IncN2、IncFII、IncH、IncHI1、pNDM-BJ01以及IncX等[16-22]，这些不同的质粒具有相似的NDM-1核心区域，且该基因上下游序列比较保守。

细菌耐药基因的出现是细菌在不同环境中增殖变异的产物，但由于长时间受不合理抗菌药物环境的刺激，使敏感菌被抑制而耐药菌得以被筛选，从而导致耐药菌的比例增加。我们应通过抗菌药物管理部门规范临床医生抗菌药物的使用，加强临床医生与实验室间的协作，减少抗菌药物滥用；加强监测，及时发现耐药菌株，并采取有效措施控制耐药菌株传播，从而最大程度地减少耐药菌株的增加。