多项肿瘤标志物联合检测模型在肺癌诊断中的应用价值

张海晨，王 浩，宋云霄，马 进

（1. 上海市徐汇区中心医院检验科，上海 200031；2.江西省精神病院检验科，江西 南昌 330029；3. 上海交通大学医学院公共卫生学院，上海 200025）

肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。50年以来，肺癌5年生存率仅提升了4%，其主要原因是检出滞后，而及早诊断和治疗可显著提高患者的生存率[1]。肿瘤标志物可用于肿瘤的筛查、诊断和预后判断等，但单个肿瘤标志物的敏感性或特异性不高，难以满足临床要求，因此临床实践中提倡多肿瘤标志物联合检测，以提高诊断敏感性和特异性。目前，用于肺癌检测的肿瘤标志物主要有糖类抗原（carbohydrate antigen，CA）、肿瘤胚胎抗原、分化抗原和增生抗原等。尽管肿瘤标志物在肿瘤的诊断、疗效评价和随访观察方面价值巨大，但临床上有大量肿瘤标志物检测被不当使用，从而造成医疗资源的巨大浪费。合理、有效地应用这些肿瘤标志物，不仅可提高检测的敏感性和特异性，也可避免过度医疗导致的资源浪费。为此，本研究收集了肺癌患者的多项肿瘤标志物检测结果，运用统计学方法，建立多肿瘤标志物联合检测模型，为临床检验策略优化提供一种可行方案。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2014年1月—2015年12月上海市徐汇区中心医院和上海中医药大学附属普陀医院收治的，经细胞学或组织病理学检查确诊为原发性肺癌（primary lung cancer，PLC）的患者318例，其中男216例、女102例，年龄36～92岁，从中随机选取280例（男187例，女93例）作为PLC组，其他38例患者用于验证运算。选取同期上海市徐汇区中心医院和上海中医药大学附属普陀医院肺良性疾病（benign pulmonary disease，BPD）患者505例，其中男327例、女178例，年龄16～106岁，从中随机选取455例患者（男302例，女153例）作为阴性对照，其他50例患者用于验证运算。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 采集所有对象空腹静脉血，2 h内离心分离血清。在24 h内进行检测的样本冷藏（2～8 ℃）保存，24 h内无法测定的样本冷冻（-20℃及以下）保存，不能反复冻融，冷冻保存的样本最多保存6个月。血清样本量不少于5 mL。

1.2.2 肿瘤标志物检测 甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、CA125、CA15-3、CA19-9、细胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA 21-1）、CA72-4、鳞状上皮细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）、神经元特异性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）采用cobas e411全自动电化学发光分析仪（瑞士罗氏公司）及配套试剂（电化学发光法）检测。肿瘤特异性生长因子（tumor specific growth factor，TSGF）采用酶法检测，试剂盒购自广州科方生物技术股份有限公司，检测仪器为ADVIA 2400全自动生化分析仪（德国西门子公司）。CA50和CA242采用MAGLUMI 800全自动化学发光分析仪（深圳市新产业生物医学工程股份有限公司）及配套试剂（化学发光免疫分析法）检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。采用Kolmogorov-Smirnov法对数据进行正态性检验。正态分布资料采用±s表示，组间比较采用t检验，相关性分析采用Pearson相关分析。非正态分布资料采用中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney检验。相关性分析采用Spearman相关分析。采用Medcalc v11软件绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，并计算曲线下面积（area under curve，AUC）、敏感性、特异性、阳性似然比（positive likelihood ratio，+LR）、阴性似然比（negative likelihood ratio，-LR）、Youden指数、最佳临界值等参数。AUC比较采用Z检验，AUC＜0.5时无诊断价值，0.5～0.7时诊断价值较低，0.7～0.9时诊断价值中等，＞0.9时诊断价值较高。应用探索性因子分析（exploratory factor analysis，EFA）提取潜在公共因子，对同一因子内的指标用综合评定法进行筛选，多指标拟合采用Logistic回归分析，用主成分分析法消除多重共线。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PLC组与BPD组12项肿瘤标志物的比较

除TSGF外，PLC组CEA、CA15-3、CA72-4、CA242、CYFRA 21-1、CA125、CA19-9、CA50、SCC-Ag、NSE和AFP水平均明显高于BPD组（P＜0.01）。见表1。

表1 PLC组与BPD组12项肿瘤标志物水平的比较

2.2 各项肿瘤标志物的ROC曲线分析

ROC曲线分析显示，CA15-3、NSE、CA125、CEA、CYFRA 21-1、CA72-4的诊断价值为中等及以上（AUC≥0.7），TSGF、CA19-9、CA242、AFP、CA50、SCC-Ag的诊断价值一般（0.5≤AUC＜0.7）。在AUC≥0.7的肿瘤标志物中，NSE的敏感性最高，且Youden指数最高，是诊断能力最强的肿瘤标志物；CEA的特异性最高，且对疾病的判断能力较强（+LR=6.67）。通过比较AUC可知，CA15-3、NSE、CA125、CEA和CYFRA 21-1的诊断能力相等（P＞0.05）；CA72-4、TSGF、CA19-9、CA242、AFP、CA50、SCCAg的AUC与CA15-3比较，差异均有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）。见表2。

2.3 多指标联合模型的建立与验证

2.3.1 提取公共因子 为提高诊断的准确性，在进行因子分析时仅选取AUC≥0.6的肿瘤标志物。此外，由于PLC组TSGF水平与BPD组比较差异无统计学意义（P＞0.05），因此进行因子分析时不纳入TSGF。分别对PLC组和BPD组的原始数据进行标化，将PLC组11项指标标化后的数据代入变量。选择KMO和Bartlett球度检验（设定特征值＞1，选择四次方最大旋转，选择取消小系数并设值为0.5）。结果输出为KMO=0.667、Bartlett球度检验P＜0.001、方差累积贡献率为100%，满足EFA分析条件。旋转后成分矩阵和旋转后3D载荷图显示PLC组11项指标被降维成4个公共因子，并按方差贡献率大小顺序排列。BPD组采用与PLC组同样的方法进行因子分析。结果输出为KMO=0.687、Bartlett球度检验P＜0.001、方差累积贡献率为86%，满足EFA分析条件。旋转后成分矩阵和旋转后3D载荷图显示BPD组11项指标被降维成3个公共因子，并按方差贡献率大小顺序进行排列。见表3、图1。

PLC组中，CA242、CA50、CA125、CA19-9在公共因子1上具有较大的载荷系数，其中CA242、CA50和CA19-9为广谱肿瘤标志物，CA125为PLC相关的肿瘤标志物[1]；CA72-4、CYFRA 21-1在公共因子2上具有较大的载荷系数，这2个肿瘤标志物均对非小细胞肺癌（nonsmall-cell lung carcinoma，NSCLC）有较高特异性[1-4]；SCC-Ag、NSE在公共因子3上具有较大的载荷系数，这2个指标分别对肺鳞癌（squamous cell lung carcinoma，SQLC）和小细胞肺癌（small-cell lung carcinoma，SCLC）有较高特异性[1-2，5-6]；CA15-3、CEA在公共因子4上具有较大的载荷系数，这2个指标对肺腺癌（adenocarcinoma，ADC）和大细胞肺癌（large cell carcinoma，LCC）的特异性较高[1-2]。AFP由于在各个公共因子中的载荷系数均较小，因此被剔除。将上述4个因子作为PLC的诊断指标，其中公共因子1诊断价值最高，可用于判断阴阳性；公共因子2、公共因子3和公共因子4次之，在帮助诊断的同时，还有助于疾病的分型；肺癌诊断辅助因子可用于辅助疾病的鉴别诊断。BPD组被提取出3个公共因子，反映了各项肿瘤标志物指标在正常人群中的分布情况及相关性。

2.3.2 拟建联合模型 经文献检索可知，11种肿瘤标志物对肺癌均有诊断价值，但AFP、CA242、CA50和CA72-4的支持文献较少[7-10]；而CA199、CA125、CYFRA 21-1、NSE、SCC-Ag、CA15-3、CEA的文献证据充分，且CYFRA 21-1、NSE、SCC-Ag和CEA被列入欧洲肿瘤标志物学会（European Group on Tumor Markers，EGTM）[11]和美国临床生化学会（the National Academy of Clinical Biochemistry，NACB）[2]的指南中，推荐用于肺癌的诊断和分型。对公共因子1中的4种肿瘤标志物进行相关性分析，结果显示CA242、CA50和CA19-9两两间呈强相关（P＜0.01）。CA19-9的诊断效能最优，CA242的诊断效能与CA50差异无统计学意义（P＞0.05），因此排除CA242和CA50，仅保留CA19-9。CA125与其他肿瘤标志物呈弱相关（P＜0.01），其诊断效能显著高于其他肿瘤标志物（P＜0.01），见表4。对其他因子内的指标采用同一方法进行筛选。在公共因子2中，CYFRA 21-1与CA72-4呈正相关（r=0.357，P＜0.01），两者的诊断效能差异无统计学意义（P＞0.05），因此排除CA72-4，保留CYFRA 21-1。在公共因子3中，NSE与SCC-Ag无相关性（r=0.019，P＞0.05），两者的诊断效能差异有统计学意义（P＜0.01），均予以保留。在公共因子4中，CA15-3与CEA呈正相关（r=0.501，P＜0.01），两者的诊断效能差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，PLC组可由CA199、CA125、CYFRA 21-1、SCC、NSE、CEA、CA15-3组成联合，标记为PLC预测模型。

表2 12项肿瘤标志物的诊断性能分析

表3 旋转后的成分矩阵

图1 PLC组和BPD组旋转后11项指标的3D载荷图

2.3.3 联合模型诊断价值 设因变量，PLC组标记为1，BPD组标记为0，采用Logistic回归分析。先进行单因素分析，筛选出P＜0.1的变量，除AFP（P=0.355）外，其他10项指标均满足条件。设因变量，PLC组标记为1，BPD组标记为0，采用Logistic回归分析，10项肿瘤标志物强制进入协变量获得预测概率（标记为Pre-P10），其AUC为0.849。PLC预测模型（PLC预测模型标记为1，与其对应的BPD组指标标记为0，两者的集合标记为PLC-BPD）获得预测概率（标记为Pre-P7）的AUC为0.831，与Pre-P10的AUC差异无统计学意义（Z=1.744，P=0.081），因此两者的诊断价值相等。

表4 4种肿瘤标志物的相关性分析和AUC比较

2.3.4 联合模型最值临界值 采用主成分分析法对PLC-BPD提取主成分，结果输出为KMO=0.627、Bartlett球度检验P＜0.001、方差累积贡献率为76%。获得主成分方程并计算结果，利用二元Logistic回归进行单因素分析，筛选出P＜0.1的变量。然后对满足条件的主成分强制进入二元Logistic回归拟合，PLC-BPD统计结果显示-2LL=195.882，Cox & Snell R2=0.482，Nagelkerke R2=0.643，H-L检验=0.306，方程为Logistic（PLC）=-3.558+0.012×CEA+0.067×CA15-3+0.0 1 9×C Y F R A 2 1-1-0.0 0 3×C A 1 2 5+0.004×CA19-9+0.164×NSE-0.070×SCC-Ag。把Logistic（PLC）方程还原成原始变量方程并代入原始数据计算结果，用Medcalc v11软件绘制ROC交互点图，最佳临界值为-0.958 8，可疑值范围为-1.276～-0.732，见图2。将余下的38例PLC患者和50例BPD患者的肿瘤标志物数据代入PLC-BPD模型，总符合率达82.9%，阳性符合率78.9%，阴性符合率86.0%。

3 讨论

图2 ROC交互点图

肺癌患者的5年生存率主要取决于肿瘤分期，Ⅰ期患者的5年生存率达60%~70%，Ⅱ期为40%～50%，ⅢA期仅为15%～30%[2]，而患者在疾病的早期阶段通常不会表现出特定的症状，因此PLC的早期确诊对后续治疗效果至关重要。目前，临床主要采用肿瘤标志物对可疑病例进行筛查、评估预后，采用电子计算机断层扫描或磁共振成像，结合组织检查，辅以肿瘤标志物检测诊断PLC。由于肺癌组织病理的多样性和同种病理肿瘤细胞的异质性，对PLC的早期诊断仅靠单项肿瘤标志物目前是无法实现的。多种肿瘤标志物联合检测对不同类型PLC诊断的互补性可以有效弥补单项肿瘤标志物检测的不足，但肿瘤标志物联合项目越多，检测结果的假阳性率越高。合理、有效、经济的使用肿瘤标志物组合既可对患者后续干预产生积极影响，也可避免不适宜检测。在国内现有的有关肿瘤标志物联合检测诊断PLC的文献报道中，多数研究将重点放在肿瘤标志物联合检测的临床价值上，但没有说明如何获取多种肿瘤标志物组合。本研究通过探索性研究，建立了诊断PLC的预测模型，并以此作为PLC的肿瘤标志物适宜检验策略。

本研究建立的PLC预测模型既包含了PLC的特异性肿瘤标志物（CYFRA 21-1、SCC-Ag、NSE、CEA），又纳入了非特异性肿瘤标志物（CA19-9、CA125、CA15-3）。CYFRA 21-1是目前对NSCLC（SQCL）最敏感的肿瘤标志物，敏感性为23%～70%[12-13]，特异性约为90%[3]。NACB和EGTM均推荐CYFRA 21-1用于NSCLC的早期诊断和疗效监测[1-2]。ADC和LLC患者CEA水平显著升高，与CYFRA 21-1结合可有效鉴别ADC和SQLC。有研究结果显示，CEA不仅可用于PLC的诊断，还可作为化疗效果的监测指标[14]。SCC-Ag是SQLC的特异性肿瘤标志物，有文献报道SCC-Ag的敏感性仅为15%～55%，不适合作为诊断指标[5]；但也有研究结果显示，SCC-Ag结合CA125、NSE、CEA和CYFRA 21-1对NSCLC的诊断和分型有帮助[1，15]。SCLC患者的NSE阳性率显著高于对照者，是SCLC高特异、高敏感的肿瘤标志物[1-2]。这些PLC特异性肿瘤标志物包含在公共因子2、3和4中，解释了不同PLC亚型对PLC预测模型的贡献率，同时联合检测这些PLC特异性肿瘤标志物也弥补了单项肿瘤标志物检测效能不足的缺陷。CA125、CA19-9和CA15-3分别是卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌的特异性指标，不是PLC的优势型肿瘤标志物。但CA125由于与肺腺癌细胞识别的免疫分子OC125相同，因此是卵巢癌和肺癌细胞共同具有的抗原；而CA15-3也被证实存在于肺腺癌内[16]。有研究结果显示，CA125、CA15-3与PLC的病理分型密切相关，SQLC以CA125阳性率升高为主，ADC以血清CA15-3水平升高为主[17-18]。另有研究结果显示，检测NSCLS患者CA15-3、CA199、CA125水平可用于监测癌细胞在体内的转移情况[19]。总之，对临床高度怀疑为PLC的患者，CA125、CA199和CA15-3结合CYFRA 21-1、CEA检测有一定的辅助诊断意义。因此，这些肿瘤标志物出现在PLC预测模型中也有其合理性。有研究结果显示，3种肿瘤标志物联合检测早期诊断PLC的最优组合为CEA、CYFRA 21-1、NSE[20-24]，4种肿瘤标志物联合检测的最优组合为CEA、CYFRA 21-1、NSE、SCC-Ag[24-25]。采用Logistic回归分析，使用PLC患者和BPD患者对这些肿瘤标志物的联合检测策略进行验证。结果显示，与其他联合检测策略比较，PLC预测模型的AUC和Youden指数均为最优，在保持敏感性基本不变的前提下，提高了特异性，且真阳性检出率大幅提高，见表5。进一步说明了本研究建立的PLC预测模型的合理性。

综上所述，本研究采用统计分析与临床实践结合的方法，对PLC的诊断指标进行了优化和组合，从临床常用于PLC诊断的12种肿瘤标志物中遴选出7种肿瘤标志物组成联合检测模型。结果显示，PLC预测模型与单项肿瘤标志物检测相比，平衡了敏感性和特异性，检测项目的减少并未降低诊断效能，而且还减轻了患者的经济负担，减少了不适宜检验，具备一定的临床应用价值。但是，该模型是否能在临床上推广应用仍有待验证。因为在制定临床检验策略时，还应根据患者的实际病情推荐更细化的方案，如基于不同病种、不同病情提出更精准、更有针对性的临床适宜检验方案，这也是我们下一步研究的方向。

表5 PLC预测模型与不同肿瘤标志物联合检测策略比较