磁性固相萃取技术在测定大黄蒽醌类成分中的应用

殷召军

(徐州市肿瘤医院，江苏 徐州 221005)

离子液，即我们通常所知的有机盐，其熔点低于100 °C，通常包括有机阳离子(例如咪唑鎓盐、吡咯鎓盐、吡啶鎓盐)和无机(或有机)的阴离子(例如四氟硼酸根、溴离子)[1-2]。自从1914年首次被发现后，离子液因其独特的性能被各领域的研究人员进行各项考察研究。离子液的理化性能包括：低蒸汽压、粘度和溶解度可调节、热稳定性良好、不燃[3]。近年来，人们发现离子液在样品萃取、光谱分析、三维测量、激光解吸/电离质谱分析和色谱分析等领域有良好的应用前景。当前，离子液对磁性材料进行功能化成为了一个热门的话题，离子液对磁性材料进行有效的功能化，归功于其阳离子结构和磁性材料表面的互动关系[4]。专家们预言，该材料在样品的分离提取方面有较大的应用前景。

磁性固相萃取(Magnetic solid-phase extraction，MSPE)，利用吸附剂的顺磁性，已经成功应用到各个领域，包括像生物、天然产物、食品以及环境水样分析等[5]。与常规的固相萃取相比，磁性固相萃取其步骤更加简洁，在减少吸附剂用量的同时，提取效果更好[6]。磁性固相萃取的成功，主要在两方面：一方面，吸附剂均匀分散在样品溶液中，而不是像固相萃取那样挤入固相萃取柱中，这样增加了吸附剂和目标分子的接触，从而提高了提取效果；另一方面，在萃取结束后，吸附剂通过外加磁场环境的回收，使得吸附剂重复循环使用，无需经过过滤或者离心分离。此外，纳米材料或磁性纳米材料诸如石墨烯、石墨烯功能化四氧化三铁这一类材料，具有较大的比表面积和独特的理化性质，在磁性固相萃取领域倍受青睐[7]。然而目前，利用离子液将四氧化三铁粒子进行功能化修饰，并将其作为吸附剂应用在固相萃取领域的案例，尚未有文献报道。

大黄，多年草本植物掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄RheumtanguticumMaxim. ex Balf.或药用大黄RheumofficinaleBaill.的根或者茎。在中国或者其他国家，作为保健食品添加剂，同时在临床上也作为一种常用的药材，用于治疗血栓和通便[8]。近年来的文章报道证明，蒽醌类衍生物因其药理学活性和治疗功效，是大黄中主要的活性成分[9-11]。本研究建立了一套以离子液包裹的四氧化三铁作为吸附剂，以超高效液相色谱仪(UPLC)作为检测手段，用于富集测定食品添加剂中的蒽醌类成分，包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚(图1)。此外，本研究详细考察了各类参数，包括离子液种类、离子液浓度、吸附剂浓度、稀释液pH、洗脱液中的酸度。实验结果表明，该方法能有效地用于大黄真实样品的测定。

图1 五个化合物的结构式

1 材料与仪器

溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑([C12mim]Br)、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑([C12mim]Cl)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(bminBF4)、1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸盐(bminPSSA)，购于上海成捷化学有限公司；甲醇(色谱级)，购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；纯净水，购于徐州娃哈哈集团有限公司；其他所有化学试剂均为分析纯，不经过进一步的净化处理。磁性四氧化三铁购于南京先锋纳米材料科技有限公司。

对照品芦荟大黄素(批号：110795-200504)、大黄酸(批号：110757-200206)、大黄素(批号：110756-200110)、大黄素甲醚(批号：110758-200610)，均购于上海融禾医药科技发展有限公司；大黄酚(批号：0796-200208)，购于中国食品药品检定研究院。每种对照品纯度均高于98%。大黄药材及其制剂颗粒购于徐州当地药店。

超高效液相色谱仪(UPLC，Waters Co.，Milford，MA，USA)，紫外检测器(UV)

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：UPLC© BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm，Waters Co.)；流动相：0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱；流速：0.5 mL min-1；进样：1 μL；波长：254 nm。梯度洗脱时间及比例：0～1 min，25%～30% B；1～3 min，30%～45% B；3～5 min，45%～60% B；5～7 min，60%～80% B；7～8 min，80%～100% B；8～8.5 min，100%～100% B。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇分别制成每1 mL含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各500 μg，大黄素甲醚250 μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液适量，按实验所需浓度混匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

大黄样品前处理方法参照《中华人民共和国药典》2015版进行提取，所述提取方法为：将大黄药材或大黄固体制剂粉碎，取粉末(过四号筛)0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 mL，超声(功率100 W，频率40 kHz)处理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得大黄提取液。

2.4 磁性固相萃取步骤

1.5 mL规格离心管内加入20 μL对照品(或样品)溶液、6.6 mg·mL-1MFMs分散液和0.32 mg·mL-1[C12mim]Cl溶液。随后，加入1000 μL纯水，快速涡旋10 s后静置5 min。在离心管底部放入一块磁铁，持续1 s左右，将磁性粒子聚集。弃去上清液，用200 μL甲醇(含有1%乙酸)洗脱3次。收集洗脱液(共计600 μL)至新的离心管内，在80 ℃水浴环境中干燥。残留物用50 μL甲醇溶解，超声(功率100 W，频率40 kHz)2 min，离心(13 000 rpm)5 min。最后，用UPLC对样品进行定性定量分析，进样体积为1 μL。

3 结果与讨论

为了得到对目标分子最优的提取效果，本研究在接下来的正交试验中，系统地考察了各项影响因素，包括离子液种类、离子液浓度、四氧化三铁浓度、稀释液pH。

3.1 离子液的选择

本研究选取了4种离子液，分别为[C12mim]Br、[C12mim]Cl、bminBF4和bminPSSA，上述4种离子液分别包括不同的阴离子。实验结果如图2所示，选用长链离子液([C12mim]Br、[C12mim]Cl)的提取效果明显优于选用短链离子液(bminBF4和bminPSSA)。可能的原因：首先，长链离子液的表面活性更接近传统的阳离子表面活性剂，在水中溶解后，呈现两性，长链离子液的阳离子基团具有烷烃长链，在功能化的过程中具有更高的分配比；其次，咪唑鎓盐类离子液的存在增加了氢键以及其他弱作用力，使得离子液和四氧化三铁以及目标分子相互作用更强烈；另外，[C12mim]Cl离子液中的氯离子其有最强烈的共轭和诱导效应，因此具有最高的紫外吸收。本研究还发现，加入离子液会使得最终的样品溶液变黄色，在这些离子液中，[C12mim]Cl组所得溶液的颜色最深。结果证明，采用[C12mim]Cl的效果最佳，因此，在后续考察中，本研究统一采用[C12mim]Cl作为最优条件。

注：1.芦荟大黄素；2.大黄酸；3.大黄素；4.大黄酚；5.大黄素甲醚。图2 离子液种类考察结果

3.2 离子液浓度的影响

离子液浓度对提取效果和目标分子的作用部位均有重要影响。在考察时，离子液浓度范围为0～0.48 mg·mL-1。结果如图3所示，离子液[C12mim]Cl的浓度在0～0.32 mg·mL-1区间内时，所测得的蒽醌类物质的富集倍数从20变到60，且在0.32 mg·mL-1时达到最优。然而，当浓度增加到0.48 mg·mL-1时，提取效果骤减。尽管此时样品分离良好，但结果表明此时目标分子和吸附剂之间的相互作用减少。此外，观察实验最后一步，所得结果的颜色均呈现黄色，尤其在浓度为0.32 mg·mL-1一组颜色最深。结果表明，提取效果受到离子本身多方面性质的综合影响，例如范德华力、静电引力和氢键等。在后续的考察中，均采用浓度为0.32 mg·mL-1的[C12mim]Cl离子液作为最优条件。

注：1.芦荟大黄素；2.大黄酸；3.大黄素；4.大黄酚；5.大黄素甲醚。图3 离子液浓度考察结果

3.3 四氧化三铁浓度的影响

在磁固相萃取中，四氧化三铁的浓度同样是一项重要的参数，因为只有它直接和目标分子相接触。在本项考察中，为了考察四氧化三铁的吸附能力并最终得到最优的浓度，我们在稀释液中加入0.32 mg·mL-1的离子液和20 μL大黄提取液，同时四氧化三铁的浓度范围在3.3～16.5 mg·mL-1，结果如图4所示。当四氧化三铁浓度增大到6.6 mg·mL-1时提取效果剧增，但当浓度变成9.9 mg·mL-1时提取效果下降，四氧化三铁在分散体系中反而降低了磁固相萃取的效果。此外，浓度在9.9～16.5 mg·mL-1的每组数据，其紫外吸收响应差别并不大。此次考察结果证明，四氧化三铁的吸附能力有饱和上限，在分散体系中具有高浓度的四氧化三铁时，从分散体系中吸附目标分子变得困难。根据实验结果，在后续的实验考察中，采用6.6 mg·mL-1浓度的磁性材料。

注：1.芦荟大黄素；2.大黄酸；3.大黄素；4.大黄酚；5.大黄素甲醚。图4 四氧化三铁粒子浓度考察结果

3.4 pH的影响

在提取环节，样品提取液的pH值也是一项重要的因素，因为它决定了离子液的状态。此外，在整个MSPE步骤优化中，pH也是一项关键的参数。在考察中，本研究采用1 mol·L-1的磷酸溶液或1 mol·L-1的氢氧化钠溶液将pH的范围调节为5～13。pH对目标分子的提取效果影响如图5所示。很显然，当pH从5增加至11时，提取效果呈现递增趋势，尤其是大黄酸(峰2)和大黄酚(峰4)。可能由于目标分子属于蒽醌类成分，其分子结构中存在羟基，羟基中的孤对电子和咪唑结构中的π电子相互作用，使得提取效果增加。然而，pH变成13后，目标分子的峰面积下降。这表明，强碱性环境下，目标分子和功能化磁性材料之间的相互作用会降低，最终影响提取效果。因此，pH选用11作为后续的考察条件。

注：1.芦荟大黄素；2.大黄酸；3.大黄素；4.大黄酚；5.大黄素甲醚。图5 样品溶液pH考察结果

3.5 方法学考察

经过优化之后，本实验系统性地考察了本技术方案的方法学参数，其中包括线性相关、精密度、重复性、检测限(LODs)、定量限(LOQs)和回收率。结果详见表1和表2。结果证明，本方案线性相关良好，相关系数r≥0.999 4。考察重复性时，我们进行了5组平行实验，峰面积和保留时间的RSD值分别低于4.32%和0.46%。本方案的日内、日间精密度均在线性范围内测定其RSD值。如表1所示，重复6次的日间精密度进样结果，其峰面积和保留时间的RSD值分别在0.95%～1.19%范围和0.18%～0.30%范围内。而对于日内精密度，峰面积和保留时间的RSD值分别低于0.25%和0.66%。检测限采用信噪比为3的结果，范围是0.000 4～0.002 8 μg·mL-1。信噪比为10的定量限结果在0.001 4～0.009 4 μg·mL-1的范围。本技术方案的回收率在89.25%～96.48%。上述结果表明本方案可以给目标分子提供一个良好的定量结果。

3.6 样品分析

借助UPLC的基于离子液功能化的磁固相萃取技术，可用于提取测定食品添加剂中的蒽醌类成分。图6展示了本研究涉及的色谱图，包括标准品的色谱图(图6A)和样品色谱图(图6B～E)。在没有经过样品前处理步骤(图6B和6D)，大黄药材和大黄颗粒制剂中的5类蒽醌类成分无法被仪器检测(低于本方法的检测限)。另一方面，经过磁性固相萃取后的目标分子能够显著提升仪器响应(图6C和6E)，且互不干扰。据观察，经过磁性富集后的目标分子提取效率明显增大，富集倍数范围在23倍(大黄素甲醚)到60倍(大黄素)之间。大黄药材和大黄颗粒中的含量测定结果分别为：芦荟大黄素 0.0146 mg·g-1和0.007 1 mg·g-1，大黄酸0.008 9 mg·g-1和0.004 7 mg·g-1，大黄素0.005 6 mg·g-1和0.002 4 mg·g-1，大黄酚0.141 1 mg·g-1和0.069 2 mg·g-1，大黄素甲醚0.033 4 mg·g-1和0.022 7 mg·g-1。很显然，大黄颗粒中的蒽醌类成分低于药材中的含量，可能由于加工过程中成分的损失。实验结果表明，本方案可以有效用于分析测定天然产物中的多种活性成分。

表1 线性关系考察结果

表2 重复性、检测限、定量限、回收率结果

注：1.芦荟大黄素Aloeemodin；2.大黄酸Rhein；3.大黄素Emodin；4.大黄酚Chrysophanol；5.大黄素甲醚Physcion。图6 样品液相色谱图

4 小结

综上所述，一种新型的基于离子液包裹分散四氧化三铁微粒的磁性固相萃取技术，并结合UPLC作为检测手段的一套方案已经建立起来，用于富集检测食品添加剂中的蒽醌类成分，目标分析物的含量可成功测定，并且各项方法学参数良好。相比较传统的分析方法，本方法优点突出显著，包括操作简捷、迅速、高效、环保。因此，本方案在天然产物提取分析领域有良好的应用前景。