HPLC同时测定黑老虎中3个木脂素类化合物的含量

杨能英，何风雷，彭富全，陈明权，农根林

(广州白云山陈李济药厂有限公司，广东 广州 510288)

黑老虎为五味子科南五味子属植物冷饭团Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith的干燥根，别名过山龙、大钻、臭饭团、钻地风等，主要分布于我国江西、湖南、福建、广西、四川、云南等地。味辛、微苦，性温，具有行气活血、祛风止痛的功能，主要用于治疗风湿痹痛、痛经、脘腹疼痛、跌打损伤等[1-2]。在民间黑老虎常用于治疗胃、十二指肠溃疡、慢性胃炎、急性胃肠炎、风湿性关节炎、痛经、产后瘀血腹痛等症[3]。黑老虎的主要生理活性成分为木脂素和三萜酸[4]。其中木脂素结构类型较多，立体化学复杂，而且具有抗肝炎、抗艾滋病毒和抗肿瘤等活性[5-6]。黑老虎药材标准收载于《广东省中药材标准》2004年版(第一册)，标准中没有含量测定项。本实验对黑老虎中3个木脂素类化合物的含量测定方法进行了研究，为黑老虎药材质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪，Sartorious(CP225D)十万分之一天平，Sartorious(BS110S)万分之一天平。SB-5200DT超声波清洗机(300 W，40 Hz)。色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 试药

日本南五味子素甲(纯度为98.2%)、乙酰日本南五味子素甲(纯度为97.5%)和(2′S)-南五味子木脂素J(纯度为98.7%)对照品，均为自制，由中国科学院华南植物园魏孝义研究员进行结构解析，鉴定[7-9]。

黑老虎药材防城港1、防城港2、防城港3采挖于广西防城港，还有采挖于福建武平、广东梅州等地的样品各1批，其余7批黑老虎药材购于广西玉林中药材市场，产地越南，批号分别为1607002、1610001、1704001、1705001、1610002、1703001、1703002，编号为越南1、越南2、越南3、越南4、越南5、越南6、越南7，由广东药科大学李钟副教授鉴定为五味子科南五味子属植物冷饭团Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith的干燥根。

乙腈、甲醇为色谱纯；水为Millipore去离子水；磷酸、乙醇等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈为流动相A，甲醇为流动相B，0.1%磷酸-水为流动相C，梯度洗脱(0→5 min，35%→40%A，5%→10%B，60%→50%C；5→30 min，40%→45%A，10%→15%B，50%→40%C；30→65 min，45%→80%A，15%→5%B，40%→15%C)；检测波长为214 nm；流速为1 mL·min-1；柱温为30 ℃。HPLC图见图1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取各对照品适量，分别置于3个50 mL量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。各成分对照品溶液的质量浓度分别为日本南五味子素甲0.177 8 mg·mL-1、乙酰日本南五味子素甲0.164 6 mg·mL-1、(2′S)-南五味子木脂素J 0.191 8 mg·mL-1。分别量取10、10、20 mL，置于同一50 mL量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品(日本南五味子素甲35.56 μg·mL-1、乙酰日本南五味子素甲32.92 μg·mL-1、(2′S)-南五味子木脂素J 76.72 μg·mL-1)。

注：A.混合对照品；B供试品；1.日本南五味子素甲；2.乙酰日本南五味子素甲；3.(2′S)-南五味子木脂素J。图1 黑老虎药材及对照品HPLC图

2.3 供试品溶液的制备

精密称取黑老虎药材细粉(过四号筛)0.5 g，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入乙醇50 mL，称定质量，超声提取30 min，取出，放冷，再次称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取上述混合对照品1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中，分别用乙醇稀释至刻度，每个质量浓度取10 μL注入高效液相色谱仪，依法测定，以对照品的进样量X(ng)为横坐标，以峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得线性回归方程，结果见表1，可以看出各成分在各自进样量范围内线性关系良好。

表1 3个木脂素成分的线性关系考察

2.5 精密度试验

取同一批号黑老虎药材(批号：1610002)，按2.3项下方法制备供试品溶液，连续进样6针，依法测定，结果日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的峰面积RSD分别为1.02%、0.86%、1.35%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批号黑老虎药材(批号：1610002)，6份，每份约0.5 g，精密称定，按2.3项下方法制备供试品溶液，依法测定，测得日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的含量RSD分别为1.85%、2.23%、1.52%(n=6)，结果表明该方法具有良好的重复性。

2.7 稳定性试验

取同一批号黑老虎药材(批号：1610002)，按2.3项下制备供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、24 h依次进样，依法测定，日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的平均峰面积分别为892.6、513.2、1475.7，RSD分别为0.98%、1.94%、2.05%(n=6)。结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

取同一批号黑老虎药材(批号：1610002)6份，每份约0.25 g，精密称定，每份中分别加入对照品溶液：日本南五味子素甲(0.177 8 mg·mL-1)2 mL、乙酰日本南五味子素甲(0.164 6 mg·mL-1)1.5 mL、(2′S)-南五味子木脂素J(0.191 8 mg·mL-1)4 mL，按2.3项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率，结果见表2。

2.9 黑老虎药材含量测定

2.9.1 黑老虎药材含量测定 取黑老虎药材10批，分别为广西防城港采挖的3个样品(防城港1，防城港2，防城港3)和产于越南的7批样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算供试品中日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的含量，结果见表3。

表2 黑老虎中3个木脂素类成分回收率试验结果

表3 10批黑老虎药材中3个木脂素成分含量测定 %

2.9.2 黑老虎药材皮部、木部含量测定 取广西防城港3个样品和越南进口4批样品，将皮部和木部分离，粉碎，取细粉(过四号筛)按2.3项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算供试品中日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的含量，结果见表4。

3 讨论

本实验采用甲醇、乙醇、70%甲醇水、70%乙醇水、稀乙醇作为提取溶剂，采用超声提取，提取效果没有显著差异，因此，选用无毒的乙醇作为提取溶剂。考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-乙腈-0.1%磷酸水等流动相的等度和梯度洗脱，通过比较3个成分的峰形、分离度及保留时间，综合考虑，最终选择了文中甲醇-乙腈-0.1%磷酸水系统，采用梯度洗脱，可以得到比较理想的色谱峰。

从10批药材含量测定结果可以看出，日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、和(2′S)-南五味子木脂素J的质量分数分别在0.021 9%～0.159 5%、0.031 8%～0.176 7%和0.036 4%～0.702 8%，3个成分中(2′S)-南五味子木脂素J含量相对较高。对于黑老虎药材的指标成分含量测定还需要收集更多的样品，确定指标成分的含量限度。

黑老虎药材的木部和皮部很容易分离，对同一样品的皮部和木部分离后，分别取其细粉，进行3个木脂素的含量测定，发现皮部和木部均含有这3个成分，但在皮部和木部中的含量并不一样，差异较大。7批样品中，日本南五味子素甲在皮部和木部的含量比最大为1∶5.8，乙酰日本南五味子素甲在皮部和木部的含量比最大为1∶3.4；(2′S)-南五味子木脂素J在皮部和木部的含量比最大为1∶34.3，且在木部中含量较高，可以看出(2′S)-南五味子木脂素J在皮部和木部的含量差异最大。皮部和木部的含量差异可能与采挖季节和生长年限有关。

(2′S)-南五味子木脂素J在体外药效实验证明，对肝癌细胞增殖具有较好的抑制作用[10]，该成分在黑老虎药材中含量相对较高，特别是在木部中含量更高，提示提取该活性成分可以考虑从木部提取或者采用木部入药。

通过对福建武平、广东梅州、广西防城港、越南等地的黑老虎样品进行检测，比较不同产地黑老虎样品中日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、和(2′S)-南五味子木脂素J的的含量，发现福建武平、广东梅州含量很低，广西防城港的样品含量相对较高，而越南进口的黑老虎样品含量更高，说明黑老虎药材中所含成分地域差异性较大。

表4 黑老虎药材皮部和木部含量测定