金莲花不同花部提取物的抗炎活性△

李德利，方明月，王青青，刘双月，赓迪，王如峰*，马超

(1.北京中医药大学 生命科学学院，北京 102488；2.北京林业大学 生物科学与技术学院，北京 100083)

金莲花又名旱金莲、旱荷、金梅草、金疙瘩等，是毛茛科金莲花属植物金莲花TrolliuschinensisBunge的干燥花，具有清热解毒、消肿明目的功效[1-2]。近年临床研究报告显示，金莲花在治疗急性咽炎、风热感冒等方面疗效显著，已有多种剂型运用于临床，有报道称金莲花抗炎的作用甚至高于临床常用的抗炎药[3-4]。金莲花化学成分明确，主要化学成分有黄酮类、酚酸类和生物碱类。其中，黄酮类的含量最高，总黄酮约占金莲花干重的16%[5-6]，被认为是金莲花中最主要的活性物质。

本课题组在前期研究中发现，金莲花的不同花部，即花萼、花冠、花蕊群(雄蕊和雌蕊)、子房、花柄中的总黄酮含量存在差异[7]；但是还不清楚它们的抗炎活性是否也有所不同，各花部的抗炎活性与其总黄酮含量是否存在相关性。为此，本文采用细菌脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞模型研究了金莲花各花部提取物对一氧化氮(NO)分子释放量的影响，并结合各花部提取物的总黄酮含量测定，对各花部提取物的抗炎活性与其总黄酮含量的相关性进行了探讨。

1 仪器与材料

1.1 仪器

KQ-300VDE型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，METTLER AE240型1/10万电子天平，旋转蒸发仪(上海亚荣生物仪器厂)，MC-18AIC(UV)CO2培养箱(Sanyo公司)，SW-CJ-10洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，ECLIPSETE2000-S倒置荧光显微镜(Nikon公司)，Epoch全自动酶标仪(Bio Tek公司)，30～300 μL八道移液器(Eppendorf公司)，1000 μL/200 μL/20 μL单道移液器(Thermo公司)。

1.2 药品与试剂

金莲花购自河北安国药材市场，经北京中医药大学王如峰教授鉴定为毛茛科金莲花属植物金莲花TrolliuschinensisBunge的干燥花。荭草素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：YD0001502-171110)；96孔细胞培养板(Corning公司)；DMEM 培养基(Gibco公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)；小鼠巨噬细胞系RAW264.7(中国医学科学院基础医学院细胞中心)；实验试剂乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、磺胺、1-萘胺均为分析纯。

2 方法

2.1 花部提取物的制备

将金莲花按各花部(花萼、花冠、花蕊群、子房、花柄)分离，取材如图1所示。称取各花部10 g，95%乙醇超声提取2次，第一次30倍量乙醇提取30 min，第二次40倍量乙醇提取30 min，合并两次提取液，四层纱布过滤，常温下减压浓缩，挥干至恒重，即得金莲花各花部提取物，各花部提取率为提取物质量/花部质量[8]。

图1 金莲花花部模式图

2.2 花部提取物总黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取荭草素对照品20.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加适量95%乙醇，50 ℃水浴加热溶解，放冷，用95%乙醇稀释至刻度。精密量取25 mL于50 mL量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度，即得对照品溶液。其中荭草素的质量浓度为200 mg·L-1。

2.2.2 标准曲线制备 精密量取对照品溶液0、1、3、5、7、9、11 mL，分别置于25 mL量瓶中，加95%乙醇至11 mL，摇匀；然后，分别加入5% NaNO2溶液1 mL，摇匀；放置6 min后，加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀；再放置6 min后，加入4% NaOH 溶液10 mL；最后，用95%乙醇稀释至体积，摇匀。放置15 min后，以第一管作为空白对照，用比色法在510 nm处测定吸光度，以质量浓度为横坐标(X)、吸光度为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，求出回归方程[8]。

2.2.3 总黄酮含量测定 称取各花部醇提取物20 mg，于1 mL 95%乙醇中完全溶解，经0.22 μm滤膜过滤后，量取0.5 mL于25 mL容量瓶中。同标准曲线制作方法，测定510 nm处吸光度(A)值，由线性回归方程计算各花部提取物总黄酮质量浓度。依公式(1)计算各花部提取物总黄酮含量(W)。各花部生药总黄酮含量为提取物总黄酮含量×提取率。

(1)

式中：C为质量浓度，V为测定体积，N为稀释倍数，M为总提取物质量，m为测定质量。

2.3 抗炎活性实验

2.3.1 最大无毒浓度 取对数生长期的RAW264.7细胞，制成密度为1.5×105个·mL-1的细胞悬液，接种于96孔板中培养，每孔100 μL。培养12 h待细胞贴壁后，弃去旧的培养液，依次加100 μL含药培养液(80、160、320、640 μg·mL-1各花部提取物和25、50、100、200、400 μmol·L-1阿司匹林)，空白对照组加等量含有PBS的培养液，每组设4个平行孔。药物作用于细胞20 h后，弃去含药培养液，每孔加入质量浓度为0.5 mg·mL-1的MTT溶液100 μL，混匀。继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min使结晶充分溶解。用酶标仪测定每孔的吸光度(A)值，检测波长为490 nm。根据测得的A值计算细胞存活率。

2.3.2 抗炎实验 通过构建LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型，Griess试剂法测定细胞培养液中NO释放量，能直观反映炎症的发生，因此以评价NO分子的分泌量来筛选抗炎药物是一种普遍运用且简单可行的方法[9-10]。取对数生长期的RAW264.7细胞，制成密度为1.5×105个·mL-1的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL，培养12 h，待细胞贴壁后弃去旧培养液。加入新鲜的含药和LPS的培养基120 μL，其中LPS质量浓度为1 μg·mL-1。设空白对照组、阴性对照组、阳性对照组(阿司匹林 25、50、100、200、400 μmol·L-1)和不同剂量加药组(16、32、64 μg·mL-1各花部提取物)，培养20 h后吸取上清液，加入Griess试剂A液(1%磺胺)，混合均匀后37 ℃孵育10 min，再加入Griess 试剂B液(0.1%N-1-萘乙二胺盐酸盐)，混合均匀后37 ℃孵育10 min。在自动酶标仪上测定540 nm下的吸光度值。根据标准曲线Y=0.001 8X+0.049 9(r=0.999 8)求出各组的NO浓度，按公式(2)计算NO抑制率。

(2)

式中：CLPS组为LPS组NO质量浓度，C实验组为实验组NO质量浓度。

2.4 数据统计分析

3 结果

3.1 花部提取物总黄酮含量

以已知浓度的荭草素为对照，制作标准曲线，得回归方程Y=0.003 6X+0.044 3(r=0.999 7)，表示对照品在8～88 μg·mL-1线性关系良好。金莲花的花萼、花冠、花蕊群、子房、花柄中均含黄酮类成分，但各花部提取物之间的总黄酮含量存在统计学差异(P<0.01)。各花部提取物中总黄酮含量顺序为：花柄>花萼>花冠>子房>花蕊群；结合各花部的提取率，计算各花部生药的总黄酮含量顺序为花萼>花柄>花冠>子房>花蕊群。具体含量见表1。

表1 金莲花各花部及提取物中总黄酮含量

注：各花部提取物及花部之间比较，**P<0.01。

3.2 花部抗炎活性

3.2.1 最大无毒浓度 采用MTT法测定了不同质量浓度的金莲花5个花部提取物及阳性药阿司匹林对RAW264.7细胞存活率的影响，结果如图2所示。金莲花的花萼、花冠、花蕊群、花柄4个花部提取物质量浓度在80～640 μg·mL-1时，子房提取物质量浓度在80～320 μg·mL-1时细胞存活率与阴性对照组无统计学差异，表明在此质量浓度下，各花部提取物对RAW264.7细胞的正常生长无毒性影响。阳性对照组阿司匹林在实验浓度(25、50、100、200、400 μmol·L-1)下对RAW264.7细胞无细胞毒作用。

注：**P<0.01表示该提取物质量浓度下具有细胞毒性。图2 各花部提取物对RAW264.7细胞存活率的影响

3.2.2 抗炎活性结果 LPS组与空白对照组相比，NO释放量明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)；阳性药阿司匹林对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量具有明显的抑制作用，其NO释放量比LPS组明显减少，且各浓度均具有统计学差异(P<0.01)，如图3所示，表示LPS能诱导炎症的发生，该细胞炎症模型构建成功。

注：与LPS组相比，**P<0.01。图3 阿司匹林对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量的影响

利用上述构建的细胞模型，用Griess试剂法测定了金莲花5个花部提取物在16～64 μg·mL-1对LPS诱导的RAW264.7细胞NO分子的释放量。与LPS组相比，花蕊群和子房两个部位在实验浓度下对NO释放量有显著性抑制作用(P<0.01)，花萼和花柄浓度在32～64 μg·mL-1时，抑制作用明显(P<0.01)，花萼在16 μg·mL-1时抑制作用较弱(P<0.05)，而花冠只在最高浓度即64 μg·mL-1时表现出抑制作用(P<0.05)，如图4所示。由抑制率公式计算NO抑制率，结果如表2所示，相同质量浓度下花蕊群和子房提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量的抑制率比其他花部高，且二者的抑制率之间无差异。其次是花萼和花柄提取物，二者对NO释放抑制作用的效果相当，均高于花冠提取物。

注：与LPS组相比，*P<0.05，**P<0.01。图4 各花部提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量的影响

表2 各花部提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放的抑制率

注：和花蕊群比较，#P<0.05，##P<0.01；和子房比较，△P<0.05，△△P<0.01；和花萼比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

3.3 各花部提取物抗炎活性与其总黄酮含量的相关性

金莲花各花部的提取物具有良好的抗炎活性，为直观反映提取物抗炎活性与其总黄酮含量之间的关系，根据3.1项下结果，计算实验条件下(16、32、64 μg·mL-1，加药体积100 μL)各花部提取物中的总黄酮含量，其与NO分子释放抑制率对应关系如图5所示。在本实验浓度范围内，各花部提取物对NO分子释放的抑制率与各自总黄酮含量之间存在剂量依赖性；即同一花部，提取物总黄酮含量越高，对NO分子释放的抑制作用越强；但从不同花部之间比较来看，各花部提取物对NO分子的抑制率与总黄酮含量之间无明显关系(Spearman相关系数r=-0.035 71，P>0.05)。如子房和花蕊群两个花部提取物中的总黄酮含量较其他花部少，抑制率却最高；花萼和花柄部位提取物的总黄酮含量最高，但对NO分子释放的抑制效果并不是最好。

图5 花部提取物总黄酮含量与NO释放抑制率的关系

4 讨论

金莲花各花部提取物及花部之间的总黄酮含量存在显著差异，即花部之间：花萼>花柄>子房>花蕊群>花冠，与文献报道一致[7]；提取物中：花柄>花萼>花冠>子房>花蕊群。为进一步明确各花部提取物中总黄酮含量和抗炎活性之间的关系，借助LPS诱导的RAW264.7细胞模型，研究了相同质量浓度下不同花部提取物对细胞NO分子释放量的影响。NO分子在炎症的发生发展过程中扮演着重要角色，参与致炎因子的分布和损伤等病理过程。通常炎症发生时，NO分子的释放量明显增加[11-12]。本文通过计算各花部提取物对NO分子的抑制率来表征各花部提取物的抗炎作用，结果表明金莲花的花萼、花冠、花蕊群、子房、花柄提取物均能抑制NO分子的产生，表现出一定程度的抗炎作用，且子房和花蕊群>花萼和花柄>花冠提取物。结合各花部提取物中的总黄酮含量测定结果，表明金莲花不同花部抗炎活性的强弱与各花部提取物中总黄酮的含量不成正比，提示黄酮类成分并不是金莲花抗炎活性的唯一药效物质。本课题组前期关于金莲花各花部的指纹图谱研究[13]也表明，虽然子房和花蕊群与其他花部的指纹图谱相似，但是其主要黄酮类成分的含量却低于其他花部。因此，除了黄酮类之外，金莲花的抗炎活性成分还应包含酚酸类和生物碱类等其他结构类型。