液质联用快速检测红花中违禁添加物金黄粉的方法研究△
2018-07-31刘征辉赵琳琳赵云平魏静娜薛天凯郭永泽
刘征辉，赵琳琳，赵云平，魏静娜，薛天凯，郭永泽*
(1.天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津 300381；2.天津海世达检测技术有限公司，天津 300381；3.天津市现代中药质量检验中心，天津 300381)
金黄粉是一种非生物合成着色剂，又名酸性橙Ⅱ、酸性金黄Ⅱ、金橙Ⅱ或酸性艳橙GR，化学名为2-萘酚偶氮对苯磺酸钠，分子式：C16H11N2NaO4S，相对分子质量：350.33，易溶于乙醇、乙腈等，是重要的精细化工产品之一。金黄粉主要用于蚕丝、毛线和羊毛的染色，羊毛、蚕丝和锦纶织物的直接印花，皮革和纸张的着色等；此外，它又是一种指示剂，医学上常用于组织切片的染色[1]。结构式如下：
金黄粉属非食用色素，具有较强的毒性和致癌性，国内外有关规定均严禁将金黄粉用于食品着色。金黄粉比通常的食用色素更不易变色褪色，而且色泽鲜艳、渗透性好、价格低廉、具有一定的坚牢度。在国家强制性标准中，对金黄粉等违禁色素的检验术语为“不得检出”[2]。
红花为菊科植物红花CarthamustinctoriusL.的筒状花冠，是一种名贵中药材，具良好的活血通经，散瘀止痛的功效。由于近年货源较缺，价格上涨，不法分子常将药厂提取过的红花重新染色出售以次充好而作假。经鉴定其染色为一种化工染料酸性橙Ⅱ(又名金黄粉)，本品具有可疑致癌作用，禁止在食品中使用，目前金黄粉的检测在国家标准及行业标准中仍是空白只有很少的几篇文献[3-9]，一般也是液相方法，没有质谱相关的方法研究，我们经过大量实验摸索，建立了液质联用法快速检测红花中金黄粉的方法，该方法灵敏高、简便易行，取得了满意的效果，适用于红花中金黄粉的测定。
1 仪器与试药
美国Waters Acquity UPLC/Waters Quattro Premier XE三重四级杆液质联用仪，配备电喷雾离子源(ESI)以及Masslynx 4.1数据采集软件。
金黄粉orangeⅡ sodium salt(Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批号：50513)；乙腈(色谱纯，美国fisher公司)，乙酸铵(色谱纯，天津市光复精细化工研究所，2016年6月19日)，超纯水(milli Q超纯水系统，过0.22 μm滤膜)。
2 方法与结果
2.1 试液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备：精密称取金黄粉对照品适量，加乙腈制成每1 mL含金黄粉对照品0.16 μg的溶液，备用；
2.1.2 供试品溶液的制备：取已粉碎并混匀的红花样品约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.01 mol·L-1乙酸铵溶液-乙腈(70∶30)25 mL，密塞，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，并补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，备用；
2.2 色谱条件
采用C18液相色谱柱：Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；以0.01 mol·L-1乙酸铵溶液-乙腈(70∶30)为流动相；流速0.2 mL·min-1；柱温为30 ℃；进样量10 μL。
2.3 质谱条件
采用电喷雾离子源，负离子电离模式，毛细管电离电压2.5 kv，取样锥孔电压15 v，离子源温度110 ℃，脱溶剂温度300 ℃，脱溶剂氮气流速550 L·hr-1，锥孔反吹氮气50 L·hr-1，扫描模式为多反应监测MRM，采集时间0～5 min，扫描时间0.3 s，间隔时间0.02 s，选择离子m/z 327Da作为目标离子，碰撞电压30 v，定性离子为m/z 93Da、171Da和247Da，定量离子为m/z 156Da，通过定量离子可以准确的锁定样品中金黄粉的含量。
图1 金黄粉标准品总离子流图
图2 金黄粉定性离子提取图
图3 金黄粉定量离子提取图
图4 红花样品总离子流图
图5 红花样品定性离子提取图
图6 红花样品定量离子提取图
2.4 样品中金黄粉的定量测定
仪器方法同上，对照品溶液和供试品溶液分别进样10μL，在对照品质谱图和样品质谱色谱图提取定量离子为m/z 156Da的色谱图进行积分，测定金黄粉质谱色谱峰的峰面积。根据标准品中金黄粉的积分峰面积和浓度的数据，计算样品中金黄粉的含量。检测结果见表1。
表1 市售A厂家红花中金黄粉含量测定结果 mg·kg-1
2.5对上述确定的测定方法进行有效性评价，其中包括专属性、线性、精密度、重复性、稳定性、测定范围。方法学研究表明，以0.01 mol·L-1乙酸铵溶液-乙腈(体积比70∶30)作为提取溶剂超声处理样品，采用液质联用法快速检测样品中的金黄粉的含量，检出限为0.8 ng，定量限2.4 ng；线性范围为2.4～240 ng(线性方程y=8.620 5x+2.346 8，r=0.999 6)；平均回收率达到96.28%(RSD=1.8，n=6)；测定红花中金黄粉含量的测量偏差为0.26%～1.32%。
3 结果与讨论
3.1实验过程中，优选0.01 mol·L-1乙酸铵溶液-乙腈(体积比70∶30)作为提取溶剂，采用超声提取方法，超声处理30 min。对目标成分提取效果好，且方法简单易操作，回收率、重复性和提取效率都达到要求。
3.2本方法与现有的检测技术[10-13]相比所具有的积极效果在于：本方法首次采用液质联用法快速测定红花中金黄粉的含量，5 min内即可完成检测，待测峰与样品中基质达到很好的分离。其优点是简便易行，方法操作性强，回收率高，重现性好。
3.3本方法所建立的快速检测方法，首次采用二级质谱，是从质谱层面上对金黄粉的含量进行准确定性定量方法。在碰撞电压30 v下，金黄粉的特征碎片离子峰组为m/z 93Da、171Da和247Da，同时提取离子峰m/z 156Da作为定量离子。
3.4目前以红花为主药入药的中成药有很多，本方法所述的快速检测方法，其中的金黄粉的检测方法可检测含有金黄粉的红花药材及含有红花的中成药。
