胸腺肽α1对C57BL/6结节病肉芽肿模型小鼠的疗效分析

毛凯来， 李 兵

海军军医大学附属长征医院呼吸内科，上海 200003

结节病是一种以非干酪性上皮样肉芽肿为病理表现、全身多系统受累的疾病，以肺脏和胸部淋巴结受累最常见。结节病目前尚无根治性治疗方法，糖皮质激素仍是首选药物，但长期使用糖皮质激素可引起严重不良反应。因此，有待研发新的治疗结节病的药物。

胸腺肽α1(Tα1)是由胸腺上皮细胞和胸腺内分泌细胞产生的活性多肽。其作为免疫调节剂，已被广泛用于病毒性肝炎、肿瘤、重症感染等多种疾病的治疗[1-3]。 研究[4]表明，结节病与1型T辅助细胞(Th1)免疫反应明显相关。本研究以分枝杆菌过氧化物歧化酶多肽A (superoxide dismutase A ,Sod A) 诱导肺结节病小鼠模型，给予其Tα1治疗，通过病理学、T细胞亚群及相关细胞因子的检测，初步探讨Tα1对结节病小鼠的治疗效果及可能的机制，为结节病的药物治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及来源 选择25只雌性、6～8周龄C57BL/6小鼠(购自第二军医大学动物实验中心)，体质量18～22 g， SPF级。注射用胸腺法新(日达仙)购自第二军医大学长征医院药房。Sod A(Gen Bank序列号： DQ768096)由上海强耀生物科技有限公司采用固相肽合成法合成，纯度>90%(高效液相色谱法)。不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)购自美国 Sigma 公司。小鼠CD3-per CP、CD4-FITC、CD8-Cy5.5、CD25-PE、Foxp3-FITC、IL-17-Cy5.5、IL-4 PE和IFN-γAPC抗体购自美国Biolgend公司。

1.2 动物模型的制备 25只C57BL/6小鼠适应性饲养7 d后按随机数字表法分为2组：模型组15只、空白对照组10只。第1天：模型组每只给予50 μg Sod A与IFA 0.25 mL混合液皮下注射；空白对照组给予0.5 mL磷酸盐缓冲液(PBS) 皮下注射。第14天：模型组给予50 μg Sod A与6 000粒琼脂糖珠(溶于0.5 mL PBS，Sod A与琼脂糖珠共价偶联)尾静脉注射；空白对照组给予PBS 0.5 mL尾静脉注射。第22天：每组随机取5只小鼠，用6%水合氯醛0.2 mL腹腔注射麻醉后，脱颈臼法处死。

1.3 Tα1干预治疗 第22～35天：将模型组剩余的10只小鼠随机分为2组，模型组5只、给药组5只。给药组每天给予10 μg Tα1腹腔注射；模型组、空白对照组每天给予0.5 mL PBS腹腔注射。第36天：小鼠经6%水合氯醛0.2 mL腹腔注射后，用脱颈臼法处死。

1.4 一般情况及组织学观察 每日观察小鼠的进食、活动、毛发等一般情况。在第22、36天处死、解剖小鼠后，观察其肺脏及肺门淋巴结改变，用摘眼球法留取外周血。取出淋巴结及肺，4%多聚甲醛固定，脱水、石蜡包埋、切片，苏木精-伊红(H-E)染色观察。免疫组化检测T细胞CD4+抗原和巨噬细胞标志性抗原Mac-2表达。

1.5 外周血中T细胞亚群及CD4/CD8检测 用摘眼球法取小鼠外周血，将外周血单核细胞(PBMC)从血液中分离出来，用佛波酯(PMA，50 ng/mL)、离子霉素(1 μg/mL)、BFA(3 μg/mL)和莫能菌素(1.4 μg/mL)刺激5 h，进行染色标记。用流式细胞仪检测Th17、调节性T细胞(Treg)、Th1、Th2、CD4、CD8。

1.6 肺组织匀浆和血浆中白细胞介素10(IL-10)、IL-17A水平检测 取小鼠相同部位的肺组织，剪碎，加入1 mL 0.9%氯化钠液，在匀浆器中研磨，制成肺组织匀浆，1 500 r/min(r=225 mm)，离心10 min，取上清。采用多因子流式细胞术检测匀浆上清和血浆中的IL-17A、IL-10水平。

2 结 果

2.1 一般情况及组织观察 小鼠在实验过程中无死亡，进食、毛发、活动情况无显著差别。造模完成后(第22天)：模型组小鼠肺门淋巴结肿大、质稍硬、活动度可、与周围组织无粘连，肺有肉眼可见的颗粒样改变；空白对照组小鼠无明显淋巴结肿大，肺无明显异常。给药完成后(第36天)：给药组小鼠肺门淋巴结肿大、质稍硬、活动度可、与周围组织无粘连，肺稍许粗糙；模型组小鼠肺门淋巴结肿和肺表现与给药组相似；空白对照组无明显异常(图1)。

图1 开始建模后第36天小鼠肺组织外观

2.2 H-E染色结果 第22天：模型组小鼠肺组织H-E染色显示，大量淋巴细胞浸润，形成多个大小不等的以类上皮细胞为中心、淋巴细胞围绕的非干酪性肉芽肿；空白对照组小鼠肺泡、肺间质结构正常，未见淋巴细浸润及肉芽肿(图2)，说明模型成功建立。

图2 开始建模后第22天小鼠肺组织H-E染色结果

第36天：H-E染色显示，模型组肺组织中可见大量淋巴细胞浸润及多个大小不等的肉芽肿；给药组肺组织中可见淋巴细胞浸润及肉芽肿，但较模型组改善；空白对照组肺泡、肺间质结构正常，未见淋巴细浸润及肉芽肿(图3)。

图3 开始建模后第36天小鼠肺组织H-E染色结果

A：空白对照组；B：模型组；C：给药组. Original magnification: ×100

2.3 免疫组化结果 模型组小鼠肉芽肿中心巨噬细胞特异性抗原Mac-2表达阳性、周围CD4+T细胞阳性(图4)。

图4 模型组小鼠肉芽肿中Mac-2表达及周围CD4+T细胞分布情况

2.4 外周血中Th1、Th2、Th17、Treg及CD4/CD8水平 模型组及给药组外周血中Th1、Th17百分比均显著高于空白对照组(P<0.05)，Th2比例与空白对照组差异无统计学意义；各组间外周血中CD4/CD8及Treg比例差异无统计学意义(图5)。

2.5 血浆和肺组织匀浆中细胞因子IL-10、IL-17A水平 模型组血浆IL-10水平低于空白对照组(P<0.05)；给药组与空白对照组、模型组血浆IL-10水平差异无统计学意义。模型组血浆IL-17A浓度高于空白对照组(P<0.05)；给药组与空白对照组、模型组血浆IL-17A水平差异无统计学意义。3组间肺组织IL-10水平差异无统计学意义。模型组肺组织IL-17A水平高于空白对照组(P<0.05)；给药组与空白对照组、模型组肺组织IL-17A差异无统计学意义(图6)。

图5 外周血Th1、Th2、Th17、Treg、CD4/CD8比较

图6 血浆和肺组织中细胞因子IL-17A、IL-10水平

3 讨 论

结节病的病因和发病机制目前尚不清楚。一般认为，结节病是在遗传、环境、感染等因素的综合影响下出现的以细胞免疫功能失调为主的免疫异常状态。研究[5]表明，结节病与Th1型免疫反应相关。而Sod A从结节病患者病灶中分离而来，与患者Th1型免疫反应相关。Swaisgood等[6]用人工合成的SodA作为免疫原成功诱导建立了肺结节病肉芽肿小鼠模型。 这一模型的病理组织形态、免疫反应特点与人类结节病肉芽肿类似。

Th17是CD4+T细胞一种亚型。IL-17是其重要效应细胞。IL-17包含6个亚型(IL-17A～F)，其中以IL-17A的生物学作用最为突出[7]。Treg是具有免疫调节功能的一种CD4+T细胞亚群，主要分泌IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)，在维持免疫耐受、调节自身免疫中起重要作用[8]。研究认为，结节病患者中，Th17分化增强[9-11]，而Treg的变化则不明确[9-13]。

本研究参考Swaisgood等[6]的方法，成功构建了C57BL/6小鼠结节病肉芽肿模型。结果发现，模型组Th1增加，外周血Th17增加，血浆和肺组织匀浆中IL-17A水平升高，而外周血Treg比例和肺组织内IL-10水平无明显变化。本研究中Th17变化情况与研究[9-11]结果。有研究[12]认为，结节病患者Treg增加，外周血及支气管肺泡灌洗液(BALF)中Treg比例升高；而Idali等[13]发现，结节病患者BALF中Treg细胞相关基因(FoxP3、IL-10、TGF-β)的表达下降。上述研究中Treg水平不一致的原因可能为：(1)一般以Foxp3为Treg的特异性标志无，但有少部分Treg为Foxp3阴性，且Foxp3亦表达于CD8+T细胞；(2)结节病涉及的免疫反应复杂，个体免疫状态也有差别。

Tα1是在1966年由Goldstein在小牛胸腺中分离纯化而来[14]。作为胸腺肽α家族的一员，其是由胸腺上皮细胞和胸腺内分泌细胞产生的高度保守的活性肽，可通过多种机制作用于免疫系统。Tα1可以促进T细胞的成熟，提高T细胞产生特定细胞因子的能力，增加Treg细胞比例[15]，已被广泛用于多种疾病的治疗，如肿瘤、重症感染、病毒性肝炎等[1-3]。目前鲜见Tα1在结节病治疗中应用的报道。本研究对结节病模型小鼠进行Tα1治疗，发现给药组小鼠肺部病理改变较模型组小鼠改善，但两组小鼠外周血Th17、Treg、IL-17A水平及肺组织IL-17A、IL-10水平差异无统计学意义，可能与本研究中小鼠数量较少、Tα1治疗时间较短有关。其具体的调节机制和药物量效关系以及临床药物实验还有待进一步研究。

综上所述，本研究结果表明，C57BL/6结节病肉芽肿模型小鼠Th17增加。Tα1对结节病肉芽肿模型小鼠有一定的疗效，其Tα1可能通过下调Th17水平达到治疗效果，但因样本量少等原因未得出有意义的结论，尚须加大样本量进一步研究。