心肌梗死微环境中氧化低密度脂蛋白对树突状细胞诱导炎症反应的影响

马元吉， 邹云增， 葛均波

复旦大学附属中山医院心内科，上海 200032

作为影响急性心肌梗死(myocardial infarction, MI)发生和发展的两个重要危险因素，高脂血症和高血压病具有较强的协同作用，而氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在这其中起着重要的作用。研究[1]发现，树突状细胞(dendritic cells, DCs)在动脉硬化斑块及梗死心肌中发生聚集。而本课题组发现，ox-LDL[2]和AngⅡ[3]能诱导DCs的成熟。因此，本研究通过体外模拟高脂血症小鼠心肌梗死(myocardial infarction, MI)和肾素-血管紧张素系统(RAS)被激活的内环境，进一步研究ox-LDL在AngⅡ的基础上诱导DCs成熟、迁移及对其引起的炎症反应的影响，并探讨可能参与其中的信号通路。

1 材料与方法

1.1 DCs的培养和分组 将C57BL/6J小鼠处死后，置入75%乙醇中浸泡，剪下双侧股骨，进行骨髓腔冲洗，将得到的骨髓细胞悬液以1 500 r/min(r=6 cm)离心 10 min，去上清。用1 mL培养基重悬细胞沉淀，再用200目滤网过滤。取9 mL含有粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)和IL-4的DCs培养基冲洗滤网，得到细胞悬液10 mL，置于含有5% CO2、37℃恒温培养箱中培养48 h。换液、半量换液。培养到第6天时，细胞计数并接种到六孔板，进行药物干预，持续48 h。分组：Medium alone组、AngⅡ(100 nmol/L)组、ox-LDL(50 μg/mL)+AngⅡ组；3组样品均加入等量的坏死心肌细胞上清液。

1.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子IL-6、TNF-α及IL-10的浓度 取DCs上清液。按照R&D system公司提供的试剂盒进行IL-6、TNF-α及IL-10的检测。用酶标仪于450 nm波长处测定光密度(D450)值，计算结果。

1.3 流式细胞术 取100 μL细胞悬液，参照抗体说明书加流式抗体(anti-CD83, anti-CD86)，避光4℃孵育45 min，PBS缓冲液洗涤；以1 500 r/min(r=6 cm)离心10 min；重复操作1次；弃上清，再加入400 μL PBS重悬细胞，上机进行流式细胞检测。

1.4 细胞迁移测定(划痕实验) 细胞培养至单层；PBS洗涤，培养基饥饿16 h；用无菌Tip划出一道划痕，PBS洗涤2次，去除划下和未贴壁细胞，显微镜下拍照；加入ox-LDL和(或)AngⅡ，继续培养24 h，显微镜下成像；计数迁移至划痕区的细胞[2]。

1.5 坏死心肌细胞的制备 为了获得坏死的心肌细胞，体外模拟心肌梗死的内环境，把HL-1心肌细胞在液氮冷冻，再37℃解冻，反复冻融5次。通过胎盘蓝染色观察坏死细胞数量，证实坏死细胞为90%以上。以3 000 r/min(r=6 cm)离心10 min，收集坏死心肌细胞上清液待用[3]。

1.6 蛋白免疫印迹法 收集细胞，抽提蛋白，测定浓度，SDS-PAGE电泳，转膜。封闭后，将膜置于抗体孵育盒，参照抗体说明书加入合适浓度的一抗，室温温育2 h或4℃过夜(>8 h)。洗膜，然后用1∶5 000 HRP标记的二抗孵育膜1 h，曝光显影。

1.7 统计学处理 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，多组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间比较采用t检验。检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 ox-LDL在AngⅡ基础上进一步增强DCs的迁移 结果(图1A)显示：AngⅡ能够增强DCs迁移，而ox-LDL可以在AngⅡ基础上进一步诱导DCs的迁移(P<0.05)。

2.2 ox-LDL在AngⅡ基础上进一步诱导DCs免疫成熟标志和协同刺激分子的表达 结果(图1B)表明：AngⅡ能够促进DCs表达成熟标志物CD83和协同刺激分子CD86；ox-LDL能够在AngⅡ的基础上进一步诱导CD83、CD86的表达(P<0.05)，说明高脂内环境较单纯的MI内环境能够进一步激发体内的炎症机制，加重梗死后心肌炎症反应。

2.3 ox-LDL在AngⅡ基础上进一步诱导DCs分泌炎性因子 结果(图1C)显示：ox-LDL能够在AngⅡ基础上进一步促进TNF-α和IL-6的分泌(P<0.05)，说明高脂状态刺激下进一步促进DCs的炎性因子的释放，加重炎症反应。

图1 ox-LDL在AngⅡ基础上进一步诱导DCs迁移能力(A)、成熟(B)和炎症因子分泌(C)

2.4 ox-LDL+AngⅡ可以诱导DCs激活NF-κB信号通路 结果(图2)表明：与单纯给予AngⅡ干预相比，ox-LDL+AngⅡ可以进一步诱导IκB和NF-κB磷酸化(P<0.05)。

图2 ox-LDL和 AngⅡ对NF-κB信号通路的影响

*P<0.05 与 Medium alone相比；&P<0.05 与 AngⅡ相比

2.5 ox-LDL+AngⅡ能够诱导DCs激活Toll样受体4(TLR4)信号通路 结果(图3A)表明：ox-LDL在AngⅡ的基础上上调了TLR4和髓样分化因子88(MyD88)的表达，同时上调了TLR4下游分子IRAK-4的磷酸化程度(P<0.05)；ox-LDL对TRIF的表达影响不大。结果提示，ox-LDL在AngⅡ的基础上进一步激活TLR4-MyD88-IRAK-4信号通路。

2.6 ox-LDL+AngⅡ能够诱导DCs表面血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)的表达 结果(图3B)表明：ox-LDL在AngⅡ的基础上能进一步上调LOX-1受体的表达(P<0.05)，提示LOX-1可能介入了高脂环境下DCs的进一步免疫成熟和炎症反应。

图3 ox-LDL+AngⅡ对DCs激活TLR4信号通路及LOX-1表达的影响

A：ox-LDL和AngⅡ对TLR4-Myd88信号通路的影响；B：ox-LDL+AngⅡ诱导LOX-1进一步表达.*P<0.05 与 Medium alone相比；&P<0.05 与 AngⅡ相比

3 讨 论

ox-LDL具有细胞毒性，是早期心室重构的危险因子，影响心脏结构和功能[4-5]。既往研究证明，ox-LDL在心脏组织中的浓度可能远高于其血液浓度，可以在损伤内皮后直接作用于心肌细胞，从而导致心肌细胞肥厚[6]。还有研究[7]提示，MI后患者血清ox-LDL抗体水平显著升高，并与MI患者死亡率正相关。同样，MI后外周血液中AngⅡ水平激增[8-9]，同时影响梗死区和非梗死区的心肌重构。

AngⅡ与ox-LDL之间有密不可分的联系[10-11]。AngⅡ和ox-LDL分别可增加冠脉内皮细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)和血管紧张素转换酶(ACE)的表达。DCs在动脉硬化斑块及梗死心肌中发生聚集，而ox-LDL[2]和AngⅡ[3]能诱导DCs的成熟。LOX-1是摄取和代谢ox-LDL的主要受体[12]。LOX-1主要表达于血管内皮细胞及纤维母细胞[13]等，而近年研究发现其在DCs表面也有表达[14]，参与抗原递呈过程。

为了揭示高脂环境下DCs免疫成熟以及炎症反应，本研究通过体外培养C57BL/6J小鼠的骨髓细胞，采用GM-CSF及IL-4诱导分化DCs。同时，为了模拟小鼠高脂及MI后RAS激活的内环境，本研究利用AngⅡ和ox-LDL干预DCs观察其免疫成熟和炎症反应情况，结果发现ox-LDL在AngⅡA基础上进一步诱导DCs免疫成熟和致炎性因子的分泌。

既往研究证实TLR4、NF-κB和LOX-1共同表达于DCs[14-15]。TLRs在免疫应答中可以通过MyD88信号通路和TRIF信号通路进行信号转导。研究[16]显示，ox-LDL诱导循环及系统炎症部分可能通过TLR4途径实现，这提示TLR4可能在脂质分子和炎症反应及MI间扮演着重要角色。既往研究[17]证实，TLR4参与动脉粥样硬化的炎症反应。另外，TLR4表达上调还被认为与急性冠脉综合征[18]以及C反应蛋白正常的冠心病患者的严重程度正相关[19]。NF-κB作为一个多向性核转录因子，参与调节免疫炎症反应和细胞增殖等。研究发现，NF-κB与动脉粥样硬化[20]和冠心病[21]的炎症反应有着密切联系。NF-κB不仅能够介导TLR4下游信号传导，而且，还能反向上调TLR4的表达，两者之间可能存在正反馈过程[22]。

本研究发现，在AngⅡ和ox-LDL同时干预时，NF-κB/IκB的磷酸化增强，提示NF-κB通路参与了ox-LDL进一步诱导DCs免疫成熟和炎症反应过程。本研究还发现，ox-LDL+AngⅡ可以诱导DCs中TLR4/MyD88的激活和IRAK-4的磷酸化；而TRIF在ox-LDL+AngⅡ作用下，表达未明显增强。IRAK-4的磷酸化是激活NF-κB通路的重要步骤，因此推断TLR4/MyD88-NF-κB通路参与DCs免疫成熟和炎症反应过程[23]。

综上所述，本研究发现，ox-LDL在Ang Ⅱ基础上进一步上调了LOX-1的表达，同时激活了TLR4/MyD88-NF-κB通路，说明LOX-1和TLR4/MyD88-NF-κB通路均介入了DCs参与高脂血症合并心肌梗死发生和发展的过程。