基于双重PCR技术的鹿茸及其伪品DNA指纹特征和鉴定

高丽君，何程远，李盈诺，巴宏宇，李梓僮，夏 薇，李明成，苑广信，张丽华，艾金霞

(1.北华大学医学检验学院临床血液与体液检验教研室，吉林 吉林 132013；2. 北华大学药学院药物分析教研室，吉林 吉林 132013；3.吉林雷宁食品药品检测技术服务有限公司，吉林 吉林 132013)

鹿茸是我国名贵中药，《本草纲目》中记载：鹿茸具有生精补髓、养血益阳和强健筋骨等功效。我国2015年版《中华人民共和国药典》中指出：鹿茸为鹿科动物梅花鹿(Cervus Nippon Temminck)或马鹿(Cervus elaphus Linnaeus)的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，前者习称“花鹿茸”，后者习称“马鹿茸”[1]。目前，鹿茸药材品种繁多、成分复杂，市场上易混品和伪品较多，再加之我国中药现行质量标准中检验方法的局限性，很难对同属的鹿茸真伪做出准确判断。目前，国内外多采用红外线、紫外线、化学和液相色谱等方法鉴别中药，这些方法虽为鹿茸药材的鉴定提供了一定的参考依据，但均存在一定的不足，例如对同科、同属、不同种的易混药材鉴别的专属性差，尤其对化学结构相似物质鉴别的特异性不强，而且操作繁琐、费用高，很难满足对中药材、尤其对中药易混品种的鉴定[2]。

分子遗传学标记技术为中药及其伪品的鉴别提供了一条新的途径[3]。线粒体DNA(mitochrondrial DNA，mtDNA)作为遗传信息的载体，是研究动物起源进化及对群体进行遗传分析的理想对象。鹿科动物mtDNA呈共价闭合环状，是细胞核外具有自主复制、转录和翻译能力的遗传物质，与核DNA比较，因其具有分子结构简单、碱基突变率高、不同区域进化速度存在差异等特点，使mtDNA成为一种有效的遗传标志[4]。线粒体细胞色素b(cytochromeb,Cytb)基因进化速度适中，是分析种内及种间遗传多样性和进化关系的适当的DNA片段，可应用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究[5-6]。细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome C oxidase subunit 1，COⅠ)是线粒体中约650 bp的一段序列，其基因进化速度比Cytb基因更快，因此可以用来区分进化非常紧密的物种[7-8]。

4.作文课堂单调少趣，作文评价轻描淡写。丰富多彩的作文课堂不仅能调动学生写作兴趣，还能有效提升学生写作能力。当前我校作文课堂模式较为单一，先理论后写作，作文教学方法如何创新化、多样化、轻松化是急需思考的。作文评价是作文教学的重要环节，是师生双向交流的主要形式。有的老师轻视作文评价，轻描淡写，寥寥数语。忽视了应带着学生去发现问题、总结问题、反思问题，以致作文批改“徒劳无功”。从调查中可以发现，绝大部分同学希望能亲身参与到作文评价中，因此我们教学应多创造学生自评，学生互评，师生互动的环节，让学生在实践中思考，参与中提高。

本课题组建立了基于鹿科动物mtDNA的Cytb和COⅠ具有特异性鉴别意义的基因序列[9-10]。在此基础上，利用Cytb及COⅠ的特性，设计了用于鉴定鹿茸的双重特异性引物，即在同一PCR反应体系中同时检测梅花鹿、马鹿、新西兰鹿和驯鹿鹿茸，达到快速、准确鉴定鹿茸真伪的目的，以期为中药真伪的鉴别提供又一新的方法。

当前，中国石油油气管网管理体制实行“1+5+5”运行模式，即1个北京油气调控中心、5家区域管道公司、5家区域天然气销售公司。

1 材料与方法

1.5 市售鹿茸样品的检测按照1.2中的方法提取鹿茸DNA，采用优化的双重PCR反应体系和反应条件对市售鹿茸进行鉴定。

1.2 鹿茸样品基因组DNA的提取采用碱变性方法提取基因组DNA[11]：①取鹿茸样品剪碎至1 mm×1 mm×1 mm左右，称取0.1 g样品加入0.01 mmol·L-1Tris-HCl 500 μL、10%SDS 30 μL和20 g·L-1PK15 μL，混匀后置于56℃水浴振荡16～18 h；②取出，加入饱和NaAC 500 μL，轻轻振荡10 min，4℃、11 000 r·min-1离心10 min，取上清液加入等体积的异丙醇，-20℃放置1 h；③ 4℃、11 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，向沉淀中加入70%乙醇500 μL 充分冲洗，4℃、11 000 r·min-1离心10 min，留沉淀室温干燥(必要时可洗涤2次)；④加入80 μL双蒸水溶解DNA，即为鹿茸基因组DNA。将所获得的基因组DNA样本经适当稀释，采用紫外分光光度仪测定吸光度(A)值，计算A(260)/A(280)比值。采用0.8%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像分析系统观察和分析结果。

DNA分子遗传标记技术在中药材鉴定中被广泛使用，该标记技术具有多态性强和准确性高等优点。利用DNA分子标记技术对鹿茸进行鉴别，直接从遗传物质DNA 的核苷酸序列上检测遗传变异，可准确鉴别鹿茸的真伪。

1.4 PCR反应条件的优化①PCR反应中特异引物的确定：分别应用Cytb及COⅠ单一引物逐一实验，反应条件及程序同1.3中所述。②PCR反应中最适解链温度的确定：分别设置单独PCR扩增Cytb 1及COⅠ1的最适解链温度分别为50℃和56℃；双重PCR扩增解链温度分别为57.5℃、58℃、58.5℃、59℃、60℃和61℃,其他条件不变。

1.1 材料、主要试剂和仪器本实验所用的鹿茸共11个批次。梅花鹿茸(吉林)由中国食品药品检定研究院提供，马鹿茸和驯鹿茸由吉林省双阳鹿养殖基地提供，新西兰鹿茸和梅花鹿茸(安徽)购自吉林省吉林市汇丰参茸行，市售鹿茸样品P1、P2、P3、P4、P5和P6购自吉林省吉林市参茸市场。样品真伪由吉林省吉林市食品药品检验所鉴定。DNA混合酶购于北京天根生物技术有限责任公司，批号：Lot#Q5328；琼脂糖购于北京康润诚业生物科技有限公司。GeneAmp R PCR System2700 Applied Biosystem(美国Perkin-Elmer公司)，UV WHITE2020D凝胶成像分析系统(美国Bio-rad公司)。

2 结 果

2.3 PCR反应中特异性引物的选择 分别应用Cytb和COⅠ单一引物进行多次实验，结果显示：应用单一引物无法鉴定鹿茸正品和伪品。将Cytb 1、Cytb 2和COⅠ1、COⅠ2、COⅠ3分别进行不同的组合，即将Cytb和COⅠ以不同的组合形式同时加入PCR反应体系，最后确定Cytb 1和COⅠ1引物组合后特异性强，能区分鹿茸正品及伪品(图2)。

M：546 bp DNA marker；Lane 1：Cervus Nippon Temminck antler(Jilin)；Lane 2：Cervus elaphus Linnaeus antler； Lane 3：Rangifer tarandus antler；Lane 4：Cervus Nippon Temminck antler(Anhui)；Lane 5：New Zealand pilose antler.

图1 鹿茸样品DNA琼脂糖凝胶电泳图

Fig.1 Electrophoregram of agarose gel of genomic DNA extracted from velvet antlers

2.4 PCR反应中最适解链温度的选择 解链温度是影响PCR扩增的一个重要因素，对于双重PCR尤其如此。由于单独进行PCR扩增时，Cytb 1及COⅠ1的最适解链温度分别为50℃和56℃，因此解链温度分别为57.5℃、58℃、58.5℃、59℃、60℃和61℃， 其他条件不变，检测双重PCR扩增效果。当解链温度在57.5℃～61.0℃时，均可实现2种目的基因的双重PCR，但以58℃时效果最好。故确定双重PCR的最适解链温度为58℃(图3)。

鹿茸作为贵重药材，产源不足但需求量增加，使得不同渠道来源的伪品、混淆品和代用品在国内的药源市场屡见不鲜。伪品鹿茸的价格昂贵却完全失去药用效果，不仅延误患者的救治，而且降低人们对中药的信任，严重影响我国传统药学的发展，更制约着中国传统医药的规范化、标准化和国际化。该情况在其他名贵中草药中也常见，如龟甲、川贝母和貂心等[12-16]。为在世界范围内弘扬我国传统的中医中药学，急需建立一套准确、有效和标准的鹿茸真伪的鉴定方法，确保药材质量，保障临床用药的安全性和准确性。

表2 5种鹿茸的纯度和浓度检测结果

2.1 鹿茸样品基因组DNA琼脂糖凝胶电泳特征 采用碱变性法从所有鹿茸及其伪品中提取DNA，梅花鹿茸(吉林、安徽)、马鹿茸、驯鹿茸和新西兰鹿茸经琼脂糖凝胶电泳均可见1条片段长度约为23 000 bp的单一条带(图1)。

M：100 bp DNA marker；Lane 1：Negative control；Lane 2：Cervus Nippon Temminck antler(Jilin)；Lane 3：Cervus elaphus Linnaeus antler；Lane 4：Rangifer tarandus antler；Lane 5：Cervus Nippon Temminck antler(Anhui)；Lane 6：New Zealand pilose antler.

图2 特异性引物琼脂糖凝胶电泳图

Fig.2 Electrophoregram of agarose gel of specific primers

2.2 鹿茸样品基因组DNA的紫外光谱分析 采用碱变性法提取鹿茸基因组DNA，测得样本A(260)/A(280)值为1.80±0.02(表2)，说明此样本无RNA和蛋白质污染。

Lane 1-8：57.5℃；Lane 9-16：58.0℃;M：100 bp DNA marker；Lane 1，9：Cervus Nippon Temminck antler(Jilin)；Lane 2，10：Cervus elaphus Linnaeus antler；Lane 3，11：Rangifer tarandus antler；Lane 4，12：Cervus Nippon Temminck antler(Anhui)；Lane 5，13：New Zealand pilose antler；Lane 6，14：Counterfeits of velvet antler；Lane 7，15： Genuine velvet antler；Lane 8，16：Negative control.

图3 选择最适解链温度的琼脂糖凝胶电泳图

Fig.3 Electrophoregram of agarose gel of determination of optimum annealing temperature

2.5 确定最优PCR反应体系和反应条件取待检样品DNA溶液0.5 μL、引物(Cytb 1及COⅠ1)各1 μL，分别置于25 μL PCR反应体系中，混匀。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃、30 s，58℃、30 s，72℃、 30 s，循环反应30次；72℃延伸10 min。

2.6 市售样品的检测结果采用确定的鹿茸DNA的提取方法及最优的PCR反应条件，对市售样品(P1、P2、P3、P4和P5)进行检测，检测结果与实际情况完全一致(图4)。进一步证明本研究建立的双重PCR技术快速鉴定鹿茸及其伪品的方法可行。

M：100 bp DNA marker；Lane 1：Cervus Nippon Temminck antler(Jilin)；Lane 2：Cervus elaphus Linnaeus antler； Lane 3：Rangifer tarandus antler；Lane 4：Cervus Nippon Temminck antler(Anhui)；Lane 5：New Zealand pilose antler；Lane 6-11：Sold velvet antler；Lane 12：Negative control.

图4 正品和市售鹿茸样品的琼脂糖凝胶电泳图

Fig.4 Electrophoregram of agarose gel of genuine and sold velvet antlers

3 讨 论

由于社会环境的影响和不同学生价值观取向不同，也直接决定其个人行为方式的差异。近年来，随着社会主义改革事业的蓬勃发展，社会生产方式及社会利益结构也发生了巨大变化。此外，再加上当代大学生价值观取向的日渐实用化及价值评判标准的日渐多元化，使得当代大学生的择业观念也逐渐呈现出一系列全新特点。

创新建设市场管理模式。确定了5家工程建设领域守信激励和失信惩戒制度建设试点单位。委属72家市场主体在全国水利建设市场信用信息平台建立了信用档案。完成了黄河水利工程建设项目招标进入公共资源交易市场的工作。

1.3 PCR扩增①引物设计：查找GenBank中鹿茸线粒体Cytb及COⅠ的已知序列，采用Premier 5.0软件进行引物设计，采用Oligo 6.0引物设计软件进行验证。针对Cytb设计了2对引物(Cytb1和Cytb2)，COⅠ设计了3对引物(COⅠ1、COⅠ2和COⅠ3)。碱基序列及扩增的片段长度见表1。②PCR反应体系：以提取的鹿茸基因组DNA为模板，灭菌双蒸水作为阴性对照进行PCR反应。反应体系25 μL，在150 μL PCR反应管中依次加入DNA混合酶12.5 μL，Cytb或COⅠ上、下游引物各1 μL，模板0.5 μL，双蒸水10 μL。③反应程序：单一PCR：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，退火温度30 s，72℃延伸30 s，30个循环后于72℃延伸10 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，90 V、40 min，100～600 bp DNA Marker作参照，凝胶成像分析系统观察和分析结果。④双重PCR扩增：在反应体系中加入Cytb及COⅠ2对引物，上、下游引物各1 μL，双蒸水8 μL，其余条件同单一PCR扩增的反应条件。检测方法与单一PCR扩增的检测方法相同。

动物线粒体在细胞中有较多的拷贝数，无论哪个生长期、哪种形态线粒体均能较好地保存下来，而且每个部位的DNA序列均完全一致，这种高保真性结构有利于物种种内、种间和进化的研究[17]。Cytb位于线粒体内膜脂质双分子层中，是线粒体本身编码的少数功能蛋白之一，进化速度合理，目前主要被用于动物的种类鉴别[18]。COⅠ比Cytb基因进化迅速，适合鉴别关系紧密的物种，尤其可鉴别动、植物亚种[19]。

事实上，学到小数的时候，学生已经掌握了数位的概念，具有一定的抽象思维能力.继续使用这种图示法纯属画蛇添足，增加学生负担，更是一种倒退.

本研究利用COⅠ和Cytb分别设计引物，采用双重PCR技术进行真伪鹿茸的鉴别。双重PCR是Chamberian等在1988年提出的，指在同一反应体系中同时加入2对引物，使2个PCR同时完成。双重PCR可同时扩增2个目的基因，具有特异性强、效率高和成本低的优势，已经被广泛应用[20]。双重PCR在同一体系中特异性地扩增2个位点，其技术难度大，需要反复实验、全面分析，才能确定特异的反应体系和反应条件等[21]。

本研究采用碱变性方法提取鹿茸及其伪品的基因组DNA，用引物设计软件分别设计出针对鹿茸的Cytb和COⅠ的特异性引物，并进行双重PCR扩增。经多次实验，确定了特异的PCR反应条件和反应体系。本研究结果显示：如果在395和525 bp处同时出现特异性条带即为鹿茸正品，反之为伪品，正品与伪品有明显差别。因此，本研究实现了从分子水平鉴定鹿茸的真伪，该方法简单、快速，结果可靠，易于推广应用。

歧义词虽难，但是基本可以穷举歧义词的所有含义，使得正确分词具有一定的概率，更为麻烦的是未登录词，如专业词汇、人名、地名、机构名、新造词，等等。在Bakeoff2003 数据上的评估结果表明，未登录词造成的分词精度失落至少比分词歧义大5 倍以上[1]。

本研究利用已确定的方法检验市售鹿茸，检验结果与吉林省吉林市食品药品检验所的结果完全一致，进一步证明本研究确定的检验方法可从分子水平鉴别鹿茸的真伪。