商业化腐乳中乳酸菌的分离与鉴定

□ 张志超 汤臣倍健股份有限公司 罗剑鸣 暨南大学 殷光玲 汤臣倍健股份有限公司

腐乳（Sufu）是一种源自中国的传统发酵大豆食品，以絮凝后的豆浆为底物经多种微生物混合发酵而成的植物奶酪状食品，可佐餐，亦可调味。在腐乳生产期间，前期发酵主要为生产菌株在豆腐坯繁殖和发酵，此时豆腐蛋白分解，淀粉糖化。后期发酵主要为酶与微生物的协同发酵，大豆蛋白被分解为低分子肽和必需氨基酸[1]，同时伴随酯类、有机酸和醇类的生成[2]，共同形成腐乳特有的香味和色泽。虽然目前腐乳的商业化生产正朝着机械化的方向发展[3]，比如前期发酵使用纯菌接种发酵代替自然发酵，之后直接装瓶进行后期发酵，但是目前仍以传统工艺为主，传统生产中仍然存在发酵周期长、影响因素多、生产效率低、安全隐患大等缺点[4]。豆腐坯在前期接种纯菌后，会置于敞开的自然条件下进行培养发酵，外加发酵时间比较长（3～6个月），难免会有各种微生物生长，给产品的品质、食用安全性带来潜在风险。

乳酸菌广泛存在于各类发酵大豆制品中，乳酸菌作为一类能够发酵糖大量生产乳酸的革兰氏阳性细菌，其代谢产物不仅影响产品的色泽、风味和品质，并且能够抑制腐败微生物，延长保质期。有研究表明，从特定发酵食品中分离鉴定出的乳酸菌可以被认为是该食品进行发酵的最佳发酵菌株，并且比其他来源的乳酸菌具有更强的适应力和竞争力。本文对市售占比较高的10种腐乳进行选择性分离，并对筛目标菌株进行基因分子鉴定。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

腐乳（白方、青方、红方）：样品购于各大超市，均在保质期内，于室温下保存。MRS培养基，购于广东环凯微生物科技有限公司；纳他霉素，购于丹尼斯克。

细菌基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型），购于TIANGEN天根生化科技（北京）有限公司；溴化乙锭（EB），TE 缓冲液，5 × TBE电泳缓冲液蛋白酶K，Lyticase，dNTP，10 × PCR Buffer，Loading Buffer，r -Taq 酶，购于上海生工有限公司。引物及其他酶制剂由英潍捷基生物技术有限公司合成提供。

1.2 仪器与设备

WS- CJ- 1F 型双面单人净化工作台，苏州净化设备有限公司；电子天平（XB120A），沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；便携式pH 计（Mettler Toledo S20K pH meter） 梅 特 勒 -托利多仪器（上海）有限公司；Thermo CO2培养恒温培养箱，Thermo 公司；Bio-RAD C100TM Thermal cycler PCR 仪（Bio-Rad，Hercules， CA， USA） ，美国ABI公司； 凝胶成像系统（Tanon 2500），中国天能公司；Sub- Cell GT BASIC 型电泳仪，意大利Bio- Rad 公司离心机（5804R），德国Eppendorf公司；手提式压力蒸汽灭菌器（SYQDXS-280A），上海申安医疗器械厂PL602- S 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品计数与分离纯化

取2g腐乳样品，溶解于18mL去离子水中，均质机均质30s后，作为10-1备用。

制备样品梯度稀释液→每个稀释梯度各取100 μL 涂布于添加纳他霉素的MRS 培养基→37 ℃厌氧倒置培养→ 挑取不同形态的菌落→通过平板划线分离法反复分离纯化→显微镜下进行形态鉴定→在MRS 液体培养基中增殖培养→甘油管冷冻保存。

1.3.2 16S rDNA序列分析与鉴定

将以上MRS肉汤培养物按照TIANGEN公司的细菌基因组DNA的提取操作说明，将提取到的各细菌基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA引物，进行特异性PCR反应。PCR扩增反应完毕后，利用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。将有目标片段的PCR反应产物用DNA测序仪进行16S rDNA序列分析，分析结果与GenBank中的基因序列进行BLAST同源性比对分析，以序列同源性大于99%为标准进行菌种归类。

50 μL PCR扩增反应体系：去离子双蒸水 33.7 μL，5×PCR buffer 10 μL，2.5mM dNTP buffer 4 μL，上下游引物共2 μL，GoTaq DNA 酶 0.3 μL。

PCR扩增引物：正向引物为27F :5’-AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’；反向引物为1319R: 5’- ACGGGCGGTGTGTAC-3’。

PCR扩增反应程序为：95 ℃预变性5min；95 ℃变性1 min，60℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环35 次；72℃延伸5 min，4 ℃保温。

2 结果与讨论

2.1 腐乳样品中乳酸菌的分离

使用MRS培养基从样品中分离LAB，但由于菌落发酵过程中微生物的多样性，每个样品都呈现出不同形态的菌落以及菌落数量（表1）。通过显微镜下观察细菌形态，去除霉菌、酵母形态的菌落，共选择162株球状或杆状菌株进行鉴定。各个样品所选择的进行鉴定的菌落数量见表1。

培养2 d后，所有样品中的菌落总数从1.2E + 02至1.5E + 04，不同样品之间差异较小。 但在培养到7 d时，FR01、FR03、FR05、FR07、FR08 出现小菌落，FR07样品中小菌落数量最高（7.584Log CFU/g）。

表1 MRS培养基上分离、纯化出的疑似菌株

表2 分离自腐乳样品中162株16S rDNA序列鉴定结果

2.2 筛选菌株16S rDNA序列鉴定结果

从以上方法中分离纯化得到的162株菌通过基因组16S rDNA 序列鉴定，鉴定结果见表2。

不同的腐乳样品中菌落种类差异较大。MRS培养基中筛选出的菌株大约90%为革兰氏阳性菌，因为革兰氏阳性菌对盐和乙醇的耐受性相对强于革兰氏阴性菌[5]。FR04样品在MRS肉汤中没有生长，这可能是因为样品生长环境与MRS培养液不同导致。乳酸菌 属 从 FR02、FR03、FR06、FR07、FR08共5个腐乳样品中分离出来，FR02、FR03均为植物乳杆菌（L.plantarum），这与鲁绯等[6]从青方腐乳中分离得到植物乳杆菌结果相一致。FR06样品中筛选鉴定出较多数量的嗜酸乳杆菌（L.acidipiscis），而来自FR07、FR08样品中的小菌落鉴定为嗜盐乳杆菌（L.halophilus），这种嗜盐细菌在盐浓度正常的MRS培养基中存在缓慢生长现象，有文献表明在许多品牌的腐乳中都能发现比较高数量级的嗜盐乳酸菌[7]。

芽 孢 杆 菌 属 在 FR03、FR05、FR06、FR07、FR08、FR09和 FR10共7个样品中有检测到，比乳杆菌属占比更高。其中包括凝结芽孢杆菌（B.coaqulans），蜡样芽孢杆菌（B.cereus）、人参土芽孢杆菌（ B.qinssengihumi）和枯草芽孢杆菌（B. subtili）。10个腐乳样品中共有5个样品分离出蜡样芽孢杆菌，通常被学者认为其在食物中的含量超过105CFU/g（mL）时就有可能带来中毒症状，而蜡样芽孢杆菌产生的肠毒素容易导致一些食源性疾病的产生[8]，有文献指出，蜡样芽孢杆菌污染腐乳的主要中间产品为酸浆水、种水和盐水[9]。仅在菌株多样化程度最高的FR07样品中检测到肠球菌属屎肠球菌（E.faecium），有研究表明，大多数肠杆菌科不耐受盐浓度升高[10]，所以以上样品中均未检测到肠杆菌科。

3 结论

不同来源的腐乳的细菌组成差异很大，表明不同腐乳生产地区的微生物差异很大，这可能是因为制作程序，发酵菌株与生产厂家环境的差异，这一点也在文献研究中被证实[8]。从10种市售腐乳中共分离得到4种乳酸菌，经16S rDNA鉴定，分别为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜盐乳酸菌以及乳杆菌Akporo7 ，为乳酸菌应用在商业化腐乳发酵，抑制腐败微生物提供研究支持。