育麟方改善老龄小鼠卵巢储备功能的实验研究*

缪晨韵 章 勤 马 景# 张 弛

1 浙江省温州市中医院 浙江 温州 325000

2 浙江省杭州市中医院 浙江 杭州 310007

3 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

高龄是导致卵巢储备功能下降（DOR）的主要原因[1]，主要表现为卵巢内卵母细胞质量和数量的双重下降，进而导致女性生育能力下降。虽然辅助生育技术的开展为广大不孕不育家庭带来福音，但高龄DOR患者在控制性超排卵过程中往往表现为卵巢低反应[2]。育麟方是浙江何氏妇科的代表方之一，治疗肾虚型不孕症，临床效果显著[3]。本实验主要研究自然衰老致DOR的卵巢组织学特点及内分泌变化规律，并观察育麟方对高龄导致DOR小鼠卵巢储备功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物：6～8周龄SPF级健康性成熟雌性C57BL/6小鼠［SCXK(沪)2012-0002］7只，质量17.7±1.0g。7～8月龄雌性C57BL/6小鼠［SCXK(京)2012-0001］50只，质量28.9±1.7g。实验动物于浙江中医药大学动物实验中心适应性喂养15d，采用分笼架式喂养，予实验中心标准饲料及净化水喂养。

1.2 实验试剂：DHEA（脱氢表雄酮）：美国GNC公司，25mg/粒，90粒/瓶；育麟方组成：菟丝子30g，蛇床子6g，枸杞子12g，当归、川芎、熟地、巴戟天、肉苁蓉各10g，覆盆子、仙灵脾、党参各15g，炙甘草3g。均购自浙江省杭州市中医院，经该院中药房鉴定符合标准。上药水煎并浓缩为相当于生药1.85g/ml，4℃冰箱中储存备用。小鼠抗苗勒管激素(AMH)-ELISA检测试剂盒（上海淇岸生物科技有限公司，批号1612041）；组织学检测试剂：HE染料、4%多聚甲醛、95%乙醇、石蜡等。

1.3 动物模型制备：选取7～8月龄C57BL/6老龄鼠50只，连续观察阴道脱落细胞涂片15d，观察动物小鼠动情周期变化，如出现动情周期紊乱或动情间期延长，则为DOR造模成功的判断标准。其中50只小鼠造模成功，进入实验。

1.4 分组及给药：将造模成功后DOR小鼠根据随机数字表法分为育麟方低剂量组、育麟方中剂量组、育麟方高剂量组、DHEA组、模型组，每组10只。青年对照组（7只）与模型组，给予蒸馏水灌胃。DHEA组根据人体DHEA 1.25mg/kg·d剂量换算并溶解于蒸馏水后，给予0.40ml/d灌胃，每日1次，连续40d。育麟方低、中、高剂量组分别给予生药6g/kg、12g/kg、25g/kg灌胃，每日1次，连续40d。

1.5 观察指标：从灌胃的第1d开始，每日08：30对所有实验小鼠进行阴道脱落细胞涂片检查，连续40d，同时记录相应数据。给药结束后1～5d内将处于动情前期或第5d尚未出现明显动情周期的小鼠采用摘眼球取血，离心后分离血清，采用酶联免疫测定血清中AMH水平。取右侧卵巢，剔除周围结缔组织，置于中性福尔马林液中固定。常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，制成病理组织切片。分别在光镜下用4×l 0、10×10、20×10倍数观察小鼠卵巢组织学变化，观察卵巢最大切面各级卵泡数目及黄体数目。

1.6 统计学方法：数据采用SPSS19.0统计软件进行处理，数据统计描述以表示，所有资料进行正态性检验，多组计量资料采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠动情周期变化：见表1。

表1 各组小鼠动情周期情况比较（）

表1 各组小鼠动情周期情况比较（）

注：与青年对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

?

2.2 各组小鼠抗苗勒管激素（AMH）水平变化：见表2。

表2 各组小鼠血清抗苗勒管激素水平（）

表2 各组小鼠血清抗苗勒管激素水平（）

注：与青年对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.01；与育麟方高剂量组比较，★P＜0.01。

?

2.3 各组动物卵巢组织学情况：①青年对照组：卵巢结构和形态清晰，各级卵泡可见，各级卵泡形态及数量正常。初级卵泡内卵母细胞完整，透明带明显，周围颗粒细胞丰富，排列整齐，层数多。②模型组：卵巢萎缩，髓质组织多，卵泡数目少，颗粒细胞层数减少，排列稀疏。闭锁卵泡较多。③育麟方低剂量组：卵巢偏小，卵巢皮质髓质结构不清晰，各级卵泡数量减少，周围颗粒细胞层数少，次级卵泡卵泡腔不清晰，内见散在颗粒细胞，黄体数量少。④育麟方中剂量组：卵巢髓质皮质结构清楚，各级卵泡可见，数量减少，颗粒细胞排列欠整齐，层数减少。⑤育麟方高剂量组：卵巢髓质皮质结构清楚，初级卵泡卵母细胞完整，呈椭圆形，周围可见透明带，颗粒细胞层数为6～8层，次级卵泡的卵泡腔偏小，可见卵丘。⑥DHEA组：各级卵泡均可见，数量及形态接近正常，偶见闭锁卵泡。初级卵泡颗粒细胞排列整齐紧密，层数较多。黄体较多，体积大小正常。与模型组比较，育麟方中、高剂量组、DHEA组的初级卵泡及卵泡总数增多。

3 讨论

根据DOR的临床表现，可将其归于中医学“月经过少”“月经先后不定期”“经断前后诸证”等范畴。肾藏精，主生殖，系胞络，为冲任之根。如若肾精不足，则冲任失养，血海无以充盈，胞宫失气血之温濡；肾气亏损，肾阳虚衰，则温化无力，无以行血通脉，气血凝滞。因而肾虚可致气血、冲任、胞宫失煦，致卵巢储备功能下降。故补肾填精、益气养血是卵巢储备功能下降的主要治法。育麟方由浙江何氏妇科历代门人根据临床经验总结所得，是治疗女性肾虚型不孕症的有效方剂。前期研究发现，育麟方对卵巢储备功能下降患者的中医证候均有较好的改善作用，并能改善卵巢内分泌功能，提高临床妊娠率，从而达到改善卵巢储备功能的目的[4]。

雌性小鼠性成熟后，卵巢可发生周期性的排卵与其分泌的相应雌性激素水平的周期性变化，同时伴随有阴道细胞学的周期性变化，故会出现动情周期。因此，动情周期的紊乱是反应卵巢功能失调的敏感指标。本实验发现，模型小鼠的动情周期较青年对照组延长，动情频率减少，育麟方高剂量组的动情周期较模型组缩短，动情频率增加，故育麟方能有效地改善自然衰老造成的动情周期紊乱状况，恢复正常的动情周期。

AMH是转化生长因子－β家族的成员之一，主要来自于卵巢的窦前卵泡和窦卵泡的颗粒细胞。AMH参与了卵泡生长的调节以及FSH敏感性的阈值，可以反映始基卵泡储备量的大小。AMH与年龄紧密相关，在整个生命周期中AMH是在持续动态变化的，其在20～30岁的时候达到顶峰，然后持续下降直到绝经期。在卵巢反应性的预测评估上，因其不随月经周期变化和敏感性，AMH被认为是各项卵巢功能评估指标中最准确的。本课题通过对老龄小鼠的研究，发现育麟方各剂量及DHEA均可提高小鼠血清AMH的水平，其中高剂量组效果最为显著。并结合卵巢组织学及卵泡数目结果来看，育麟方能在一定程度上促进卵泡的生长发育，改善卵巢功能。

本实验研究也发现，育麟方各剂量组及DHEA组的AMH值均低于青年对照组（P＜0.01），表明育麟方和DHEA药物干预虽可改善卵巢功能，但无法完全逆转。造成此结果的原因可能是在自然衰老过程中，卵巢的氧化性损伤不是完全可逆的，其损伤影响最大的是始基卵泡数量减少[5]。但通过药物干预提高始基卵泡的发育率、提高卵泡的质量并非是不可能的。综上，发挥中医中药的特色优势改善卵巢功能，对于帮助女性延缓生殖衰老，提高高龄女性妊娠成功率及活产率有着十分重要的意义。