一测多评法测定山楂叶提取物中4种成分的含量*

徐宝欣，杜义龙，潘海峰，赵胜男

（承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室， 河北承德 067000）

山楂叶提取物是蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂 Crataegus pinnatifida Bge.的干燥叶经加工制成的提取物，其成方制剂为益心酮片。本课题组多年来采用高效液相色谱法等不同的分析手段，通过测定不同采收期、不同产地的山楂叶及制剂中多种成分和总黄酮成分含量，在建立指纹图谱的基础上评价了山楂叶及其制剂的质量[1-6]。本课题组在研究过程中一直利用外标曲线法（ESM）测定其中目标成分的含量，但外标法所用的对照品价格昂贵，甚至有些对照品性质不稳定，因此增加了含量测定的成本和难度，限制了多成分质量控制模式在企业生产、科研和监督中的应用。一测多评法（QAMS）可在缺少对照品或对照品不稳定的情况下对中药及其制剂进行快速、低廉的质量控制。为此，本研究采用一测多评法测定山楂叶提取物中4种成分的含量，以期建立适用性更强的含量测定方法，完善山楂叶提取物的质量标准。

1 仪器与试药

1200 Series高效液相色谱仪（美国Agilentg公司），配套Chemstation色谱工作站；AG-245型十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒）。

10批山楂叶提取物（山东临沂爱康药业有限公司，批号：AKH15-1～AKH15-10）；牡荆素鼠李糖苷（批号：16060103）、牡荆素葡萄糖苷（批号：16072806）、金丝桃苷（批号：16081504）、牡荆素（批号：16070601），均购买于成都普飞德生物技术有限公司。四氢呋喃、甲醇、乙腈为色谱纯（购买于美国Fisher公司）；纯净水（购买于娃哈哈集团有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18（250×4.6 mm，5μm）；流动相为0.6%乙酸水-乙腈-四氢呋喃系统，梯度洗脱：0～10min，7～15%乙腈，10～25min，15%乙腈，四氢呋喃25min内所占比例一直为2%；检测波长350nm；体积流量1ml/min；柱温30℃；进样量0.01μl。

2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称量牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、金丝桃苷、牡荆素对照品适量，用流动相溶解，制成每1ml含牡荆素鼠李糖苷1.046mg、牡荆素葡萄糖苷0.756mg、金丝桃苷0.219mg、牡荆素0.211mg的混合溶液，作为储备液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取样品0.025g，置具磨口塞10ml量瓶中，加60%无水乙醇溶解并稀释到刻度，进样前以微孔滤膜(0.45μm有机膜)滤过，取续滤液即得。

2.4 线性关系考察 量取2.2中混合对照品储备液适量，按倍数稀释法制成一系列对照品溶液。按2.1的色谱条件进行测定，记录4种成分的峰面积。以待测成分进样量质量（μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，分别得到4种成分的回归方程和线性范围。见表1：

表1 4种成分的回归方程与线性范围

2.5 精密度试验 取倍数稀释后的混合对照品溶液（2.2），按同一色谱条件（2.1）连续进样测定6次，分别记录4个成分的峰面积。结果牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、金丝桃苷、牡荆素峰面积的RSD值分别为1.33%、0.94%、0.80%、0.72%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取2.3中的供试品溶液，测定样品室温下放置0、2、4、8、12、24h的峰面积，4种成分24h内峰面积的RSD值分别为1.02%、1.52%、1.31%、0.84%（n=6），表明供试品溶液在24h内基本稳定。

2.7 重复性试验 取同一批样品适量，按2.3的方法制备6份溶液，按2.1的色谱条件进行测定，4个成分峰面积的RSD值分别为0.62%、0.84%、1.58%、1.08%，结果表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取同一批样品适量，分别加入一定量的4种成分对照品，按2.3的方法制备6份溶液，以2.1的色谱条件进行测定，计算加样回收率及RSD值。结果4种成分的回收率依次为100.82%、99.62%、102.88%、99.40%，RSD值分别为0.54%、1.22%、1.47%、2.16%，结果符合2015版《中国药典》的要求［7］。

2.9 相对校正因子（RCF）的计算 本研究以牡荆素葡萄糖苷为内标物，按一测多评法公式［8］计算，结合系列混合对照品溶液所测得的峰面积，计算牡荆素葡萄糖苷对另外3种成分的RCF值。结果，牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、牡荆素的RCF值分别为0.963、1.116、1.034。

2.10 RCF耐用性的考察 本研究考察了不同仪器（Agilent1200、Agilent1220、Agilent1260）和不同色谱柱[色谱柱型号均为(5μm，250×4.6mm)]对RCF的影响，结果见表2：RCF在本研究考察的仪器与色谱柱中耐用性较好（RSD＜3%）。

表2 不同仪器和色谱柱测得的RCF

2.11 样品含量的测定 分别取10批山楂叶提取物适量，按照2.3的方法制备供试品溶液，按照2.1的色谱条件进样测定，对比了经典外标曲线法与一测多评法测得的4种成分的含量，见表3：一测多评法（QAMS）与外标曲线法（ESM）测定结果比较，牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、牡荆素的含量无明显差异。

表3 样品中4种成分的含量测定结果（mg/g）

3 讨论

山楂叶提取物目前收载于2015版药典，仅以金丝桃苷单一成分作为质量标准，存在一定的局限性。本研究对山楂叶提取物中4种成分建立了一测多评法，在方法建立的过程中发现，影响此方法的因素有很多，包括仪器、色谱柱、实验环境等。本研究为保证方法的适用性和重现性，对不同型号、不同产家仪器和不同品牌的色谱柱进行了考察，结果显示山楂叶提取物中选用牡荆素葡萄糖苷为内标物时，牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷和牡荆素的相对校正因子具有很好的重现性。另外，内参物的选择、待测成分浓度、色谱条件等也是一测多评法是否成功建立的主要内部因素。

本研究以牡荆素葡萄糖苷为内标物，外标曲线法与一测多评法测定牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、牡荆素3种成分的含量无明显差异，且易得、稳定、检测成本低，综合考虑故选择牡荆素葡萄糖苷为内标物。

因此，本研究建立的一测多评法稳定性、重复性、精密度好，可用于山楂叶提取物中牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、金丝桃苷和牡荆素含量的同时测定。