2型糖尿病大鼠胰腺IRS-1 mRNA表达的变化及丝胶的调控作用*

李东哲，王丹丹，侯丽娜，宋成军，陈志宏

（承德医学院人体解剖学教研室，河北承德 067000）

1921年，加拿大人F.G.班廷和C.H.贝斯特首先发现了胰岛素，它是在内源性或外源性物质，如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激下由胰岛β细胞分泌的。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是机体内唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。胰岛素通过与靶细胞表面的受体结合后磷酸化胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS），然后主要通过介导PI3K-Akt（PKB）信号通路和MAPK信号通路发挥效应。研究者发现，在胰岛β细胞也存在胰岛素PI3K-Akt信号通路，主要作用是调控胰岛素分泌，维持β细胞的生长和增殖等[1]。作为PI3K-Akt信号通路重要的上游分子，本研究探讨了丝胶（彩色蚕茧水提取物）对2型糖尿病大鼠胰腺IRS-1 mRNA表达的影响，一方面为丰富丝胶作用的研究提供数据支持，另一方面为糖尿病发病机制和治疗方法的研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物、处置及分组 36只雄性SD大鼠，自北京维通利华实验动物技术有限公司购买，合格证号SCXK（京）2012-0001。大鼠随机分组，每组12只，分别是正常组、糖尿病模型组和丝胶用药组。

糖尿病模型组和丝胶用药组大鼠采用高脂饲料+高糖饲料喂养并联合链脲佐菌素（35mg/kg，2次）腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型，以空腹血糖≥11.1mmol/L作为成模标准。成功建模后，丝胶用药组大鼠给予2.4g/kg/d的丝胶灌胃治疗35天；正常组、糖尿病模型组大鼠给予同等体积生理盐水灌胃相同时间。

1.2 制备丝胶 1%的Na2CO3浸泡蚕茧30min（浴比1：30），95～100℃沸煮3h（2次），合并2次提取液并减压浓缩，8000～14000nm透析袋透析过夜，透析液冷冻干燥成粉末，即得丝胶。

1.3 大鼠取材和检测相关指标

1.3.1 取材：大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，经心脏取血后断头处死，迅速取出胰腺，于液氮中加入Trizol研磨后入液氮保存。

1.3.2 检测血糖：所取大鼠血液3000转/min离心20min，收集血清，检测血糖水平采取葡萄糖氧化酶法。

1.3.2 检测胰腺IRS-1 mRNA的表达：采用Real Time Q-PCR法。引物的设计与合成由宝生物工程（大连）有限公司完成，引物序列见附表。取胰腺提取总RNA后，反转录为cDNA；采用pGM-T质粒载体构建IRS-1和内参GAPDH标准品用以后续定量；扩增IR和GAPDH，得到标准曲线、扩增曲线和溶解曲线。以IRS-1拷贝数与GAPDH拷贝数的比值作为IRS-1 mRNA的相对表达水平。

附表 Real Time Q-PCR法引物序列表

2 结果

2.1 大鼠的血糖水平 糖尿病模型组大鼠的血糖为(29.45±4.82)mmol/L，明显高于正常对照组大鼠[(10.83±2.03)mmol/L，P＜0.05]；丝胶用药组大鼠的血糖为(13.20±4.09)mmol/L，明显低于模型组大鼠(P＜0.05)。见图1：

图1 各组大鼠的血糖水平

2.2 大鼠胰腺IRS-1 mRNA的表达情况 以pMD18-T-IRS-1阳性质粒DNA的不同浓度梯度（6.65×108-6.65×104）和样品做为模板，经Real Time PCR扩增，得到标准曲线、扩增曲线和溶解曲线，结果见图2。标准曲线显示相关系数r=-0.999，斜率=-3.08604，截距=31.187，扩增效率为110.882%；扩增动力学曲线呈典型的S型曲线，同时，样品扩增曲线均在标准曲线范围内；溶解曲线呈单峰，无非特异型扩增，表明产物单一，扩增特异性较好。

与正常组（0.016±0.007）比较，糖尿病模型组大鼠胰腺IRS-1 mRNA（0.005±0.003）的表达明显降低(P＜0.05)；丝胶用药组大鼠胰腺IRS-1 mRNA（0.013±0.008）的表达明显高于糖尿病模型组(P＜0.05)。

图2 Real Time Q-PCR法IRS-1 mRNA的表达

3 讨论

胰岛素受体底物(IRS)是参与胰岛素及其他细胞因子信号转导的磷酸化蛋白，具有十几个酪氨酸残基，能够被激活的胰岛素受体酪氨酸激酶作用，磷酸化的IRS能够结合并激活下游效应物。IRS家族目前已发现有6个成员，IRS1-1～IRS-6，他们的基因结构基本相似，但在组织分布、亚细胞定位、发育过程的表达时序、与胰岛素的结合及与含SH2蛋白质的相互作用方面存在差异[2-3]。

IRS家族成员中，IRS-1是最早被发现的。人的IRS-1基因位于2号染色体上，包含21个假定的络氨酸磷酸化位点，其中的有些位点可与包括PI3K调节亚基p85在内的含有SH2结构的分子结合[4]。研究发现，IRS-1在脂肪细胞、骨骼肌细胞及其他多种组织细胞中发挥着重要作用。IRS-1在脂肪细胞分化中起重要作用，可通过PI3K-Akt信号通路改善脂肪组织胰岛素抵抗[5-6]；在骨骼肌细胞中，IRS-1低表达与胰岛素抵抗和2型糖尿病密切相关[7]；在其他组织细胞，IRS-1在IGF-1介导的促生长过程中扮演重要角色[8]。

以前的研究认为，只在外周靶组织，如肝脏、肌肉、脂肪组织中存在胰岛素抵抗，因而强调外周抵抗在2型糖尿病发病中的作用[9]。1995年，Harbeck等[1]发现胰岛β细胞亦表达有胰岛素受体、IRS-1及胰岛素信号通路，主要为PI3K-Akt信号通路和钙通道及其相关途径。胰岛素与细胞膜上的IR结合后，激活IRβ亚基的蛋白酪氨酸激酶（PTK），使IR受体自身磷酸化，同时通过磷酸化IRS-1的酪氨酸使IRS-1活化，活化的IRS-1转移到细胞膜上，通过PTB（磷酸酪氨酸结合域）将磷酸酪氨酸固定在IRS-1的酪氨酸激酶上。其后，酪氨酸磷酸化的IRS-1与SH2（含肉瘤同源区段2）结构域的相关信号分子结合，进而激活PI3K-Akt信号途径，从而抑制β细胞凋亡、促进β细胞增殖[10-11]。有研究显示，胰岛β细胞IRS-1基因敲除的小鼠，表现出胰岛素分泌减少和2型糖尿病[12]。本研究结果亦证实了这一点，糖尿病模型组大鼠血糖明显升高，胰腺IRS-1 mRNA的表达明显降低。

为降低口服西药治疗糖尿病时的毒副作用，研究者们一直在探寻治疗糖尿病的天然物质。根据民间蚕茧泡水降血糖的验方，以及我国多家中医古籍的记载，本研究提取蚕茧中能溶于水的蛋白质—丝胶（蛋白），并给予2型糖尿病大鼠灌胃治疗。结果显示，不但模型大鼠的血糖明显降低，同时糖尿病模型大鼠胰腺IRS-1 mRNA的表达明显升高。提示丝胶可能通过上调胰腺IRS-1的表达，进而通过影响胰岛素相关信号的传导，促进胰岛β细胞增殖，起到降血糖的作用，但丝胶治疗糖尿病的具体机制尚需深入研究。