超低温冷冻保存中华鲟F1精子授精方法研究

舒德斌，刘雪清，张建明，肖 衎，赵 珣，郭柏福，姜 华，杜合军

( 1.中国长江三峡集团有限公司中华鲟研究所，湖北 宜昌 443100；2.三峡工程鱼类资源保护湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443100 )

中华鲟(Acipensersinensis)隶属于鲟形目、鲟科、鲟属，是典型的溯河生殖洄游性鱼类，主要分布于我国东海、黄海和渤海大陆架水域及流入其中的大型河流中[1]，是我国特有的大型古老鱼类，属国家一级重点保护动物。葛洲坝水利枢纽的修建阻隔了中华鲟生殖洄游通道，其他人类活动和环境因素对其影响日益加重，中华鲟自然繁殖群体资源已极度濒危[2-3]。中华鲟自然繁殖种群的性腺发育质量也有明显下降的趋势，雌雄性比失调及种群结构的变化和产卵场环境的改变将对中华鲟种群自然繁殖产生重要影响[4-5]。

精液超低温冷冻保存技术在众多的物种保护领域中具有重要的科研和应用价值，不仅可以用于种质资源的保存，也可以解决雌雄个体发育时空上的不一致[6]。国内外有学者对鱼类精子超低温冷冻保存技术进行了研究，并取得了一定进展[6-8]。中华鲟精液超低温冷冻保存技术的研究与应用对解决中华鲟人工增殖过程中遇到的雄鱼数量不足、雌雄亲鱼性腺发育不同步及其遗传多样性和种质资源的保存问题具有十分重要的意义。目前，柳凌等[9-10]先后开展了中华鲟精子超低温冷冻保存和冻精授精试验，获得2.22%～6.98%的受精率；郭柏福等[11]在成功实现中华鲟全人工繁殖成功后，进行了中华鲟冻精授精试验，获得5%的受精率和0.5%的孵化率。这些研究虽然取得了初步成效，但超低温冻存的精子受精率和孵化率均较低。冻精授精技术为鱼类精子冷冻保存技术中关键一环。为此，笔者于2011—2013年间连续开展了研究工作，研究了授精方式、冻精用量及激活液对冻精授精效果的影响，旨在提高中华鲟冻精受精率和孵化率，优化中华鲟全人工繁殖技术体系。

1 材料与方法

1.1 材料来源

用于试验的中华鲟精、卵均取自2010—2013年中华鲟研究所三峡基地和黄柏河基地蓄养成熟的中华鲟F1雄、雌亲鱼。雄鱼经人工催产采集无污染的精液，按60～80 mL/袋分装于双层塑料保鲜袋中充氧，置于2～4 ℃的培养箱中短期保存，用作对照组，部分精液于-196 ℃的液氮中超低温冷冻保存，用作冻精授精试验。雌鱼经催产采卵后立即进行授精试验。

1.2 精子冷冻、解冻及质量评价

取活力大于80%的鲜精按两步降温法进行冷冻后浸入液氮中保存[9]。38～40 ℃水浴解冻，精液溶解后立即在显微镜下检查精子活力。具体方法为：用一次性注射器针头蘸取精液与载玻片上30 μL的井水混合，用针头搅散，立即在100倍显微镜下观察精子的运动情况。活力检测由同一个人完成，每样重复3次。精子活力为视野内快速活动精子占精子总数的百分比。用伊红染色法对精子活力评估进行补充校验[13]。

1.3 不同激活液授精效果比较

1.3.1 激活液的配制

用于比较的4种激活液配方见表1。

表1 4种不同的激活液

注: B液参考文献[14].

1.3.2 操作方法

用2010年冷冻保存的(冷冻保存360 d)活力为(37.64±3.8)%的中华鲟F1精液，按精卵体积比1∶10，分别用A液、B液、C液、D液和水激活，进行干法授精。每组设3个平行。

1.4 不同授精方法比较

试验中用3 mL中华鲟F1冻精与10 mL中华鲟F1卵子，分别采用干法和湿法授精。在确认雌鱼排卵后，开始解冻复苏精子，进行冻精授精试验。每组设3个平行组，1个对照组。2012年和2013年先后进行了3次授精方法比较试验。其中试验1和试验2使用的是2012年冷冻保存的中华鲟F1精液；试验3使用的是2010年冷冻保存的中华鲟F1精液，试验用卵子质量稍差。授精操作方法在文献[15]方法的基础上稍加调整。

湿法授精：直径10 cm一次性平底塑料碗，将卵子和冻精各放到碗底一侧(不混合)，再加水缓慢搅拌均匀，1 min后用清水冲洗除去多余精子，置于25%的滑石粉溶液中气动脱黏，60 min后转入孵化器孵化。

干法授精：直径10 cm一次性平底塑料碗，放入卵子后加入冻精搅拌均匀，再加水缓慢搅拌1 min后，用清水冲洗除去多余精子，置于25%的滑石粉溶液中气动脱黏，60 min后转入孵化器孵化。

1.5 冷冻精液用量比较

用2012年冷冻保存的中华鲟F1精液，其冷冻保存365 d，密度为3.82×109个/mL，稀释比1∶2，活力为(35.45±5.26)%，按0.1、0.3、0.6、1.5、3 mL用量分别与10 mL中华鲟F1卵子进行湿法授精。

1.6 数据的统计与分析

根据《中华鲟人工繁殖技术规程》[16]，鱼卵发育至原肠晚期时统计受精率，鱼卵发育至出膜前期时统计孵化率。相关数据采用Excel和SPSS 19.0统计软件进行数据的计算分析。

2 结 果

2.1 激活液对冻精受精率的影响

冷冻保存360 d的冻精活力为(37.64±3.8)%，按精卵体积比1∶10，分别用A液、B液、C液、D液和水激活干法授精，结果显示，用水激活授精的受精率和孵化率均显著高于其他激活液(P<0.05)，分别获得(15.04±0.58)%的受精率和(14.6±0.59)%的孵化率(图1)。

图1 不同激活液受精率和孵化率比较字母不同表示具有显著性差异(P<0.05)，下同.

2.2 授精方式对受精率的影响

试验1、试验2和试验3的湿法受精率和孵化率分别为(18.3±1.45)%、(13.57±0.76)%、(18.65±0.42)%和(16.82±2.01)%、(11.03±0.98)%、(15.87±1.25)%；干法受精率和孵化率分别为(9.49±1.21)%、(6.96±2.01)%、(8.31±0.19)%和(7.66±0.53)%、(4.11±1.58)%、(6.26±0.24)%。结果显示，湿法授精效果均优于干法授精，且具有显著性差异(P<0.05)(表2)。

表2 授精方式对受精率的影响 %

注:表中同列不同字母表示具有显著性差异(P<0.05).

2.3 冻精用量对受精率的影响

冻精用量对受精率和孵化率有一定影响。随着冻精用量的增加，受精率和孵化率先升后降(图2)，0.6 mL时受精率和孵化率较高，分别为(16.43±1.57)%和(14.58±1.35)%。此后，随着冻精用量的增加，受精率和孵化率呈下降趋势，与0.6 mL组相比差异显著(P<0.05)。

图2 冻精用量对受精率的影响

3 讨 论

3.1 激活液对受精率的影响

通常认为，冷冻精子解冻后其活力及受精能力将会显著降低，采用低渗溶液激活精子，其运动效果好于用淡水激活[17-19]。Tris-HCl为鲟鱼精子激活液的常用成分，其主要用作pH缓冲成份[20-23]，适宜含量的Na+、K+、Ca2+、Mg2+和葡萄糖可以提高中华鲟精子活力[24-26]。本试验结果显示，同样条件下，用水激活授精的受精率和孵化率均显著高于其他激活液。可显著增加中华鲟冻精被激活后运动速度的激活液B液[14]，在本试验中并未获得较高的受精率和孵化率。分析认为，可能提高精子活力的条件，不一定适合卵子受精的条件，即激活液对卵子受精的环境条件产生了不利的影响。甘芳等[27]研究显示，适量的阳离子和葡萄糖作为中华鲟鲜精激活授精介质时可提高中华鲟卵受精率。笔者推测这种差异除了超低温冷冻给中华鲟精子带来冷冻损伤的因素外[10]，是否还与试验中的4种激活液均含有Tris-HCl及冻精的抗冻稀释液成分有关，有待进一步研究。

3.2 干法和湿法授精对受精率的影响

本试验中干法授精和湿法授精最大的不同是在授精过程中，干法授精是将卵子和冻精先进行充分混合，然后进行激活授精；而湿法授精是将冻精和卵子用水激活同时混合授精。试验结果显示，同样条件下，湿法授精效果优于干法授精。这可能是因为干法授精时，精卵充分混合过程中，冻精含有的抗冻稀释液影响其与卵子混合接触，即干法授精混合接触的时间和相对含量比湿法授精时的要长要高，不利中华鲟卵子的受精。

3.3 冻精用量对受精率的影响

冻精的用量是影响受精率的重要因素之一。有研究表明，在活力一定的情况下，随着用量的增加受精率呈直线上升趋势，有的可接近鲜精受精率水平。如肖志忠等[28]研究发现，大黄鱼(Pseudosiaenacrocea)冻精授精时的精卵比高于0.8×106∶1，受精率均接近鲜精受精率；当精卵比低到一定比值时，受精率会降至35%。陈松林等[19]研究发现，草鱼(Ctenopharyngodonidellus)和鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)冻精授精的精卵比一定范围内，受精率随着密度的增加呈直线上升；当精卵比超过1.6×106∶1时，受精率接近鲜精水平，再增加时受精率基本不变。西伯利亚鲟(Acipenserbaeri)授精的最佳精卵比也取得了近似的结果[26]。本试验结果表明，冻精用量为0.1～0.6 mL，随着用量的增加，受精率呈上升趋势，超过0.6 mL，受精率则随之下降。分析认为，在最佳精卵比的基础上，除了鱼类精子的生理特性不同外，在加大冻精用量的同时，也加大了抗冻稀释液对卵子受精不利的影响。

根据冻精生理特性寻找有效的激活授精方法是提高冻精受精率的关键之一[6]。本试验重点研究了授精方式、冻精用量及激活液对冻精授精效果的影响。在中华鲟冻精授精过程中，采用水激活、湿法授精及适宜授精的精卵比例这3种方法的有效组合，在保证足够的冻精活力前提下，尽可能减少中华鲟冻精抗冻稀释液和精子激活液对精子、卵子受精能力的不利影响，可以提高中华鲟冻精授精的受精率。