植物精油在鱼类养殖中的研究与应用

崔惠敬，孟玉霞，赵前程,2，吕 可，边楚涵，马永生

( 1.大连海洋大学 食品科学与工程学院，辽宁 大连 116023；2.新兴际华伊犁农牧科技发展有限公司，新疆 伊宁 835000 )

自20世纪90年代开始，中国水产养殖一直位于世界主导地位。2015年我国水产品总产量达6.699×107t，其中养殖产量为4.937×107t，占总产量的73.7%，也是世界上唯一养殖产量超过捕捞量的国家[1]。然而，随着规模化和集约化养殖水平的提高，水产动物病害问题日趋严重。我国平均每年因水产养殖病害造成的损失达百亿元，其中鱼类约占55%～77%、贝类约占3%～16%、甲壳类约占11%～28%[2]。

目前水产动物病害防治主要依赖抗生素、抗寄生虫药及消毒剂等化学药物，常引起细菌耐药性、环境污染及水产品中药物残留等问题。免疫防治虽是水产动物疾病控制的有效途径，但我国渔用疫苗研发及应用相对滞后，目前只有4个水产动物疫苗获国家新兽药证书，其中仅珠江水产研究所研发的草鱼出血病活疫苗和嗜水气单胞菌灭活疫苗分别于2011年和2012年被批准生产使用，可用商品化渔用疫苗数量极其有限，远不能满足水产动物疫病防治的需求。因此，水产养殖中亟需安全高效、天然无残留的饲用抗生素替代品。至今报道具有潜在应用前景的水产用抗生素替代品有中草药[3]、噬菌体[4]、卵黄免疫球蛋白[5]和植物精油[6]等。

植物精油又称挥发油，广泛存在于芳香植物中，现已知的植物精油超过3000种，其中约有300余种已广泛应用于食品、制药和香料等行业[7]。近来鉴于植物精油的高效抗菌作用，因此其被视为潜在的饲用抗生素替代品，尤其在畜禽和反刍动物中研究较多，如肉桂醛和丁香酚可有效减少肠炎沙门氏菌(Salmonellaenterica)在肉鸡盲肠中的定殖[8]；薄荷(Menthaarvensis)精油能提高断奶仔猪回肠蛋白质和氨基酸消化率，从而显著改善饲料效率[9]；牛至(Origanumvulgare)精油可控制由金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大肠杆菌(Escherichiacoli)引起的奶牛乳房炎[10]等，Zeng等[11-13]也综述了关于植物精油在畜禽和反刍动物生产中应用。近来研究发现植物精油同样能有效防治水产动物细菌性疾病、水霉病和寄生虫病，且能增强鱼非特异性免疫力，提高鱼类生产性能，并在尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[14-15]、蟾胡子鲇(Clariasbatrachus)[16]、金鱼(Carassiusauratus)[17]等养殖中取得了显著成效。笔者综述了植物精油作为抗菌剂、杀虫剂、免疫增强剂及生长促进剂在鱼类养殖中的研究进展，旨在为水产动物生态健康养殖提供参考。

1 植物精油应用于鱼类病害的防治

1.1 精油对养殖鱼类细菌性疾病的防治

细菌是水产动物病害的主要病原，占生物源性疾病的57.6%[2]。常见致病菌包括弧菌属(Vibrio)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、气单胞菌属(Aeromonas)和链球菌属(Streptococcus)等。细菌性疾病的防治仍主要依赖抗生素和人工合成抗菌药，目前我国水产用抗生素共有3类4个品种，分别为氨基糖苷类的硫酸新霉素粉、四环素类的盐酸多西环素、酰胺类的氟苯尼考和甲砜霉素；另含磺胺类和喹诺酮类两大人工合成类抗菌药物，共11个品种[18]。但农业部2292号公告决定自2016年12月31日起，停止在食品动物中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和诺氟沙星4种喹诺酮类抗菌药[19]，这也给水产动物病害防控带来挑战，迫切需要研发新型抗生素替代品来防治水产养殖动物细菌性疾病。

现已证实，植物精油具有抗水产动物致病菌活性。Lee等[20]发现，丁香(Syzygiumaromaticum)精油对海鱼弧菌(V.damsela)、迟钝爱德华氏菌(E.tarda)和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)的最低抑菌质量浓度为0.015～0.062 μg/mL，但该研究未通过体内试验验证。Thomas等[16]将印度苦楝油制备成纳米乳剂，其体外抗菌活性与环丙沙星相当；对蟾胡子鲇进行肌肉注射，可有效防治由杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)引起的溃疡性病变，治疗组鱼存活率可由50%提高至90%。

精油理想的给药方式是药浴或通过混饲口服。Rattanachaikunsopon等[14]研究显示，丁香精油对格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)的最低抑菌质量浓度为30 μg/mL，饲料中添加3%丁香精油使经格氏乳球菌攻毒感染后的尼罗罗非鱼的累积死亡率由50%降至0%。与此类似，肉桂(Cinnamomumverum)精油对海豚链球菌(S.iniae)的最低抑菌质量浓度为40 μg/mL，饲料中添加0.4%肉桂精油，使经海豚链球菌攻毒感染的尼罗罗非鱼累积死亡率降低50%[15]。混饲口服精油的问题是，鱼被致病菌感染发病后，一般摄食下降或停止，此时经口给药就难以实施；此外，某些精油的味道也可能影响鱼的摄食。

上述研究均为淡水养殖鱼类，海水养殖鱼类尚鲜见报道。笔者所在实验室首次研究了植物精油或其组分对养殖大菱鲆(Scophthalmusmaximus)关键致病菌迟缓爱德华氏菌和大菱鲆弧菌的体外和体内抗菌活性，结果显示，肉桂醛、丁香酚、百里香酚、柠檬草、山苍子及柠檬醛对迟钝爱德华氏菌和大菱鲆弧菌分离株均有强烈抑制作用，最低抑菌含量为0.25～1 μL/mL[24]；给大菱鲆腹腔注射大菱鲆弧菌(V.scophthalmi)攻毒，后经200 μL/L山苍子精油(Litseacubeba)浸浴处理，结果显示，精油治疗组死亡率由对照组50%降至0%[25]，防治效果较为显著。

1.2 植物精油对养殖鱼类水霉病的防治

水霉是卵菌纲、水霉目下类真菌微生物的统称[26]，广泛分布于各淡水水域，其中对养殖鱼类危害较大主要是水霉科下的3个属，分别为水霉属(Saprolegnia)、绵霉属(Achlya)和丝囊霉属(Aphanomyces)[27]，淡水养殖中尤以寄生水霉(S.parasitica)、澳大利亚水霉(S.australis)和异枝水霉(S.diclina)最为常见。水霉易感染鱼卵以及体表有伤的鱼苗和成鱼，是困扰虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、大西洋鲑(Salmosalar)和草鱼(Ctenopharyngodonidellus)等养殖鱼类的主要病原之一。三苯甲烷类染料孔雀石绿曾被用作水霉病防治的有效化学药物，但鉴于其致癌、致畸和致突变性，早在2002年我国农业部就将其列入《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》。曾用过氧化氢[28]、臭氧[29]、甲醛[30]和高含量氯化钠(1%～3%)[31]等替代孔雀石绿，但安全性和治疗有效性均难以达到水产养殖需求。因此，采用安全高效的替代药物防治水霉病，是水产养殖及水产品质量安全领域需迫切解决的问题，而植物精油不失为一种潜在选择。

诸多研究已证实，植物精油能有效抑制黄曲霉、赫曲霉和寄生曲霉等食品中常见真菌，并控制真菌毒素产生[32]。与此相似，最近有学者尝试将精油用于控制水霉。体外试验中Adel等[33]发现刺芹(Eryngiumcampestre)和大蒜(Alliumsativum)精油对寄生水霉具有较强抑制效果，最低杀菌质量浓度分别为0.5 μg/mL和0.12 μg/mL。林岗等[34]研究发现，山苍子精油能损伤分离自鳗鲡(Anguillajaponica)同丝水霉(S.monoica)卵孢子和菌丝细胞壁及细胞膜，抑制孢子萌发和菌丝生长。

鱼卵胚胎发育早期易感染水霉，一般寄生于死卵上的水霉易传染至活卵，严重影响孵化率。Khosravi等[35]研究发现波斯苏(Zatariamultiflora)精油对寄生水霉的最低抑菌质量浓度为0.9 μL/L；将被水霉感染的虹鳟鱼卵在含10 μL/L波斯苏精油的水中浸浴60 min，日处理3次，鱼卵平均孵化率由1%提高至11%。但精油在水中溶解度低，难以发挥有效抗菌活性，故该研究中精油抗水霉活性仍低于孔雀石绿。值得注意的是，波斯苏精油的主要成分是百里香酚和香芹酚，推测一些与此主要成分相似的精油，如牛至油也应具有类似抗水霉活性，这值得进一步研究。

Madrid等[36]发现，智利香皮茶(Laureliopsisphilippiana)树皮精油与树叶精油对从大西洋鲑分离得到的水霉抑制效果显著，其最低抑菌质量浓度分别为30 μg/mL和100 μg/mL，最低杀菌质量浓度分别为50 μg/mL和125 μg/mL。可见，同种植物不同组织中精油组分及其含量存在差异，故显示不同的抗菌活性。

1.3 植物精油对养殖鱼类寄生虫病的防治

寄生虫病是鱼类养殖中的主要病害之一，据全国水产技术推广总站提供的数据，2010年，全国30个省99种水产养殖对象中共发生了94种疾病，其中寄生虫病占了24种[37]。鱼类寄生虫种类繁多，分类学上主要包括原生动物门、扁形动物门、线形动物门、棘头动物门及节肢动物门，其中扁形动物、线形动物和棘头动物习惯上被统称为寄生蠕虫。寄生虫对鱼体危害包括造成鱼组织机械损伤、掠夺宿主营养、压挤宿主组织器官及释放毒素等，最终导致宿主鱼生长缓慢，甚至死亡[38]。我国现行渔用驱杀虫药物包括内服药和外用药两大类，其中内服药有盐酸氯苯胍、阿苯达唑及吡喹酮等，外用药包括硫酸锌、敌百虫、高效氯氰菊酯等[39]。但这些化学驱虫药不可避免带来水产品药物残留及水体环境污染等问题。因此，在绿色健康水产养殖模式的发展趋势和要求下，迫切需要寻求一种安全有效的新型驱杀虫药物。

车轮虫(Trichodina)是一大类寄生性纤毛虫原生动物，广泛寄生于淡海水鱼、贝及甲壳类的鳃、皮肤等部位，可导致宿主严重的组织病变。印楝油提取于楝科植物印楝(Azadirachtaindica)，其主要活性组分为萜类化合物印楝素。吴伟等[40]研究发现，印楝素具有较强的细胞渗透性，对车轮虫有良好的杀灭效果。将感染寄生虫的鲤鱼(Cyprinuscarpio)浸入含0.2～0.8 mg/L印楝素的水体中，3 d后发现鲤鱼鳃上的车轮虫数量分别减少40%～92%，驱杀效果与使用剂量呈正相关。同样的，Kumar等[17]使用20 mg/L的印楝素处理鲺(Argulus)，体外试验发现2.5 h后，所有寄生虫均死亡；体内试验发现，相同质量浓度印楝素浸浴感染鲺的金鱼，48 h寄生虫完全死亡。

单殖吸虫属扁型动物门吸虫纲，可寄生在多种水生生物上，以鱼类最常见。Boijink等[41]将大盖巨脂鲤(Colossomamacropomum)稚鱼在质量浓度为10、15 mg/L的丁香罗勒(Ocimumgratissimum)精油中浸浴15 min，7 d后鳃上的单殖吸虫数量分别减少了94%和100%。

2 植物精油对养殖鱼类免疫功能的影响

免疫增强剂又称免疫刺激剂，能提高机体非特异性或特异性免疫功能，增强机体抗疾病感染能力。鱼类免疫增强剂主要通过增强非特异性免疫应答而发挥作用，如促进溶菌酶、天然溶血素、补体、巨噬细胞活化因子及干扰素等的合成，或增强巨噬细胞、嗜中性粒细胞等吞噬活性[42]。目前，黄芪多糖、β-葡聚糖等植物源免疫增强剂已被成功应用于水产养殖动物病害防治，植物精油也是其中一种潜在的水产动物免疫增强剂[43]。

链球菌是危害养殖罗非鱼的关键病原，临床分离株主要有海豚链球菌和无乳链球菌(S.agalactiae)两种，前者在短时间内造成罗非鱼很高致死率(>50%)。Acar等[44]向罗非鱼日粮中分别添加0.1%、0.3%或0.5%甜橙精油，连续饲喂90 d后，鱼血清溶菌酶、过氧化物酶活性和吞噬细胞活性显著提高；且罗非鱼经海豚链球菌攻毒感染后的存活率由13.3%提高至58.3%。Awad等[45]发现，饲料中添加3%黑枯茗(Nigellasativa)精油显著提高了虹鳟鱼血液中溶菌酶活性、吞噬细胞及免疫球蛋白活性。Soltani等[46]在鲤鱼饲料中添加30、60 mg/kg的波斯苏精油，连续饲喂8 d，后发现鲤鱼血清杀菌活性、白细胞数均显著增加，但对鲤鱼血清溶菌酶活性无影响。波斯苏精油的主要组分为百里香酚、香芹酚和对伞花烃，因此，未来很有必要考察每种精油单体组分对鱼的免疫调节作用。

也有研究直接使用芳香植物的叶子作为饲料添加剂。Nguyen等[47]在饲料中添加2%～8%山苍子叶粉末，连续饲喂21 d后，鲤鱼血液中溶菌酶活性、溶血素及吞噬细胞等非特异性免疫指标显著升高。值得注意的是，该研究中山苍子叶精油的主

表1 植物精油在控制水产动物病害中的应用及效果

注：a表示未给出水霉的具体种别.

要组分为芳樟醇(94.9%)，而我国西南地区山苍子果实中的精油主要为柠檬醛，存在明显区别。这也提示不同化学型的植物原料中精油组分存在较大差异，这也给精油生物活性研究的横向比较带来了困难。

目前，植物精油对鱼类免疫调节的确切机制尚不清楚，但可以从鱼类肠道菌群调节角度予以部分解释。以陆生动物为例，Li等[48]研究证实，百里香酚和肉桂醛混合精油能减少仔猪粪中大肠杆菌数量，并增加乳酸杆菌的数量；Mitsch等[49]研究证实，精油能减少产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)在肉鸡肠道中的定殖。鉴于肠道微生物在鱼类免疫系统发育和成熟过程中发挥重要作用，并且肠道菌群可通过特定代谢产物调节宿主的免疫反应[50]，据此推测，植物精油的免疫调节活性可能与其肠道菌群调节作用相关。不过，Navarrete等[51]曾用温度梯度凝胶电泳方法研究发现，日粮中添加20 mg/kg百里香精油对虹鳟肠道微生物组成并无显著影响，其原因可能与精油的选择或虹鳟肠道微生物的特征组成有关。可见，精油对鱼类肠道菌群及免疫机能的调节作用还需要在其他鱼种中尝试更多不同的精油进行验证。

3 植物精油对养殖鱼类生长性能的影响

动物养殖业中常在动物饲料中使用抗生素类生长促进剂，但基于动物性食品质量安全和公共卫生安全的考虑，目前已被逐渐禁用，如欧盟与韩国已相继于2006年1月和2011年7月起全面禁止抗生素类促生长剂。植物精油作为饲用抗生素替代品已广泛用于动物饲料中，其中牛至精油已被列入我国饲料药物添加剂附录一目录中，可在饲料中长时间添加使用[52]，具体产品如“诺必达”、“好力高”等。但这些产品主要用于陆生动物养殖中，以预防动物疾病，促进动物生长。

与此类似，Acar等[44]在饲料中添加0.1%甜橙精油，连续饲喂12周，与对照组相比，甜橙精油使罗非鱼质量增加率提高21%，饲料系数由1.69降至1.31。值得注意的是，在此项研究中，当将精油添加剂量提至0.3%或0.5%时，促生长功效却显著下降，这提示在应用精油时需要优化添加剂量。

提取后的精油易挥发并发生氧化，贮藏稳定性差，故也有研究直接使用含精油的植物组织粉末作为添加剂，Nguyen等[47]在鲤鱼饲料中添加8%山苍子叶粉末，饲喂21 d，鱼体质量增加量提高88.2%，特定生长速率由0.56%升至0.99%，饲料系数由4.70降至2.48，也取得了理想的促生长效果。

目前关于植物精油促进鱼类生长的机理研究尚鲜见报道，不过一些在畜禽中的研究结果可能会给我们提供一些参考。目前已知，植物精油可通过提高肠道胰蛋白酶和淀粉酶活性[53]，促进小肠绒毛生长，增加小肠隐窝深度[54]以及调节肠道菌群而发挥促生长作用[48]，但这些机制是否适用于鱼类还有待进一步研究。

4 结论与展望

植物精油具有高效抗菌和天然安全的优势，是一种极具潜力的饲用抗生素替代品，且兼具驱杀虫和免疫增强的功效。将植物精油应用于水产养殖中，有望实现水产动物养殖过程中“免抗生素防病”的目的，也为从源头解决养殖水产品存在的药物残留问题提供了新途径。

植物精油作为水产饲料添加剂尚存在诸多需要解决的问题：(1)植物精油成分十分复杂，包括几十种含量不同的化合物，各组分间又可能存在交互作用，具体作用机制难以完全阐明；(2)植物精油组分均为脂溶性小分子，透皮吸收，不同给药方式下精油在水产动物体内的吸收、分布、代谢及排泄等药代动力学规律尚需进一步研究；(3)目前植物精油对养殖鱼类的毒性和毒理数据缺乏，未来需要通过大量的动物体内试验来研究精油对特定水产养殖动物的急、慢性毒性，为选择及安全使用精油提供参考。