MNNG、CDCA构建胃黏膜上皮细胞GES-1肠化生模型的可行性

刘洪，王珅，蒋凯林，黄远程，李培武，高淑靖，潘静琳，黄德裕,刘凤斌

(1广州中医药大学，广州 510405；2广州中医药大学第一附属医院)

萎缩性胃炎和肠上皮化生被认为是胃癌癌前病变(PLGC)[1]。目前关于PLGC的细胞学研究较少，PLGC细胞模型尚未统一，迫切需要构建PLGC细胞的模型标准，以推动抗萎缩性胃炎和肠上皮化生药物及相关机制的研究。鹅脱氧胆酸(CDCA)是胆盐的原体，可模拟胆汁反流对胃黏膜的伤害刺激，可用于PLGC动物模型的制备[2]，但鲜见用于复制PLGC细胞模型[3]。N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)是一种常见化学诱变剂及致癌剂，可用于模拟硝酸盐在胃内转化为亚硝酸胺等致癌物质的过程[4]。2017年3月～2018年1月，本研究分别应用CDCA、MNNG作用于人胃黏膜上皮细胞GES-1，探讨二者构建胃黏膜PLGC细胞模型的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃黏膜上皮细胞GES-1购自中国科学院上海细胞库。RPMI 1640培养基(批号：8114273)，FBS(批号：1133067)，0.25%胰酶&0.02%EDTA(批号：13010501)，均购自美国Gibco公司；RNAiso Plus(批号：9109)，5×PrimeScript RT Master Mix(批号：RR360A)，2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(批号：RR820A)，均购自TaKaRa公司；CCK-8试剂盒(日本同仁 WST®)；MNNG购自日本东京株式公社，CDCA购自Sigma公司。引物设计合成由Takara公司完成[5]。黏蛋白1(MUC1)-F：TTTCCAGCCCGGGATACCTA，MUC1-R：AGAGGCTGCTG-CCACCATTA；黏蛋白2(MUC2)-F：CGTCTGCAAGT-GCAACACCA，MUC2-R：CTCAGCATTCCCGTGAACACA；尾型同源框转录因子2(CDX2)-F：TTCACTACAGTCGCTACATCACCA，CDX2-R：CTGCGGTTC-TGAAACCAGATT；GAPDH-F：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，GAPDH-R：TGGTGAAGACGCCAGTGGA。

1.2 细胞培养 GES-1细胞常规培养于含10% FBS、1%双抗的RPMI 1640培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3 CDCA、MNNG对GES-1细胞10%抑制浓度(IC10)的确定 将GES-1细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养生长至约80%融合时传代，采用胰酶消化成单个细胞，室温下以1 000 r/min 离心5 min，用培养基吹打混匀，然后按3 000个/孔均匀接种到96孔板中，培养12 h待细胞完全贴壁后更换培养基。分别加入含CDCA、MNNG的完全培养基，CDCA、MNNG起始浓度分别为2.00、640.00 μmol/L，2倍倍比稀释成7个浓度，每个浓度设6个复孔，培养24 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养1 h，450 nm波长下检测各孔光密度(OD)值。结果显示，CDCA、MNNG对GES-1细胞均具有抑制作用，CDCA、MNNG对GES-1细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为0.42、173.79 μmol/L，IC10分别为0.14、51.89 μmol/L。见表1、2。

表1 各浓度CDCA对GES-1细胞的生长抑制作用

表2 各浓度MNNG对GES-1细胞的生长抑制作用

1.4 CDCA、MNNG对GES-1细胞MUC1、MUC2、CDX2 mRNA表达影响的观察 采用实时荧光定量PCR法。将GES-1细胞以5×104个/孔接种于6孔板中，培养12 h待细胞完全贴壁后更换培养基。将GES-1细胞随机分为CDCA组、MNNG组，分别加入IC10的CDCA、MNNG，同时设未加药物处理的细胞为对照组，各组细胞均培养24 h，收集细胞。根据RNAiso试剂盒说明书提取细胞总RNA，以逆转录反应体系合成cDNA。以cDNA为模板用SYBR Green Ⅰ荧光染料进行PCR扩增。以GAPDH为内参基因，反应体系为20 μL，其中2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L) 0.8 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μL，cDNA 2 μL，超纯水6.4 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。每个样本重复3次，取其平均数为样本CT值，设定对照组的基因表达量为1，应用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

2 结果

与对照组比较，CDCA组、MNNG组MUC1 mRNA相对表达量均降低，MNNG组MUC2 mRNA相对表达量降低，组间比较P均<0.05。见表3。

表3 三组细胞MUC1、MUC2、CDX2 mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

评价细胞模型复制成功与否的标准大体概括为两点，一是细胞形态发生变化，二是细胞出现特异性蛋白表达。细胞形态发生变化主要表现为经过MNNG处理后的细胞从初始的梭形，随传代的继续形态逐渐变为不规则，细胞间接触紧密，呈“岛样”克隆生长，克隆间界限清楚，以梭形细胞环绕。多数细胞具有单核，也可出现多核巨大细胞，细胞质内可见空泡[6]。本研究通过镜下观察，发现CDCA、MNNG刺激后，细胞形态均呈现长梭形，较正常细胞细长。

消化道MUC是消化道屏障的主要成分，主要由黏膜杯状细胞分泌，具有润滑和保护消化道上皮、促进上皮细胞损伤修复的作用[7]。MUC1主要表达于正常胃黏膜，同时在一些肿瘤中也表达[8，9]，也可用于肿瘤的免疫治疗[10]。研究发现，在正常胃黏膜向肠上皮化生、不典型增生、胃癌演变过程中，MUC1表达率呈下调趋势[11]。MUC2在正常胃黏膜中不表达，主要表达于十二指肠和空肠，在胃黏膜肠上皮化生或恶化时也会表达[12,13]。CDX2是尾型同源盒基因家族成员，其编码的蛋白是肠道特异性基因的主要调节因子，参与细胞分化[14]。CDX2主要通过介导Hox 基因表达维护肠道细胞的正常形态，在胃肠道的表达仅局限于肠道上皮细胞[15]；在肠型胃癌中，CDX2 蛋白表达可进一步诱导 MUC2 表达[16]；在胃贲门腺癌患者中可能由HP感染导致其上调，诱导炎症反应[17]；可作为胃黏膜肠上皮化生的标志，其高表达常提示肠上皮化生或恶化[18]。因此，MUC1、MUC2与CDX2可作为正常胃黏膜上皮细胞肠化甚至恶化的特异性观察指标。

本研究分别采用不同浓度CDCA、MNNG刺激胃黏膜上皮细胞，结果显示，CDCA、MNNG均可抑制正常胃黏膜细胞生长，提示二者对胃黏膜细胞具有生长抑制作用。选用IC10的CDCA、MNNG刺激GES-1细胞24 h，结果显示，CDCA组、MNNG组MUC1 mRNA相对表达量均下调，符合PLGC发病中MUC1的表达变化趋势[11]。有研究报道，100 μmol/L CDCA刺激GES-1细胞24 h后MUC2 mRNA和蛋白表达上调[19]。本研究结果显示，CDCA组、MNNG组胃黏膜上皮细胞MUC2 mRNA表达下调，尤其是MNNG组下调明显。结果产生差异的原因可能与CDCA作用浓度有关，下一步可对不同浓度CDCA刺激GES-1后MUC2的表达变化进行研究。CDCA刺激GES-1后CDX2表达呈现上升趋势，与既往报道[20]一致。而MNNG刺激后CDX2呈现轻微下降，可能是由于MNNG通过抑制核转录因子CDX2表达，从而对GES-1细胞的增殖起到了抑制作用。

综上所述，CDCA、MNNG可抑制胃黏膜上皮细胞生长；二者通过下调胃特异性基因MUC1表达、上调肠特异性基因CDX2表达模拟胃黏膜肠化生细胞学改变。CDCA及MNNG可用于构建胃黏膜细胞的肠化生模型。