SMAD基因家族PCR引物设计及其在非小细胞肺癌中的表达

林高阳，高大登，袁方，刘振波

(青岛大学附属青岛市海慈医疗集团，山东青岛266033)

聚合酶链式反应(PCR)是一种体外酶促合成、扩增特定基因或DNA片段的方法，已在多个领域得到广泛应用，如基因分离、克隆、核酸序列分析、胎儿性别鉴定、癌症治疗监控、基因突变检测等。近年来，基础医学对转化生长因子β(TGF-β)/SMAD信号通路及SMAD基因家族与各种疾病的研究不断升温，SMAD基因家族的PCR检测技术应用也更加广泛。引物设计是影响PCR试验的重要参数之一，一对高度有效的基因引物序列可以更好地检测基因表达变化。目前，虽然引物设计软件的功能趋于完善，但关于计算机引物设计程序的文献还不多。2017年1～12月，本研究以SMAD基因家族引物设计为例，对引物设计原则和软件引物设计的方法进行了分析，同时应用RT-PCR技术检测SMAD基因家族在人正常支气管上皮细胞系BEAS-2B和非小细胞肺癌A549、SK-MES-1、H1299中的表达变化，旨在为进一步研究SMAD基因提供条件。

1 材料

人正常支气管上皮细胞系BEAS-2B，肺腺癌细胞系A549、H1299，肺鳞癌细胞系SK-MES-1均购自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection. ATCC，Manassas, VA, USA)；TRIzol购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR检测试剂盒购自TaKaRa生物科技公司；SMAD基因家族引物自主设计，碱基序列由华大生物科技有限公司合成，应用Applied Biosystems(ABI)7900 Fast Real-Time PCR System进行检测。

2 方法与结果

2.1 SMAD基因家族(SMAD1～SMAD8)特异引物设计及验证 在NCBI数据库中搜索SMAD1～SMAD8基因序列，应用Premier Primer5.0软件，按照引物设计的基本原则进行引物设计。引物设计流程：获取SMAD基因序列(NCBI、Gramene、EBI等)；序列编辑与整理(明确SMAD家族成员的可变剪切体数目)；确定引物设计的位置蛋白质编码(CDS)区；引物特异比对及综合评价(BLAST、Oligo6.0等)；引物合成；PCR扩增试验验证(扩增曲线、溶解曲线、凝胶成像等)。SMAD1～8基因分别设计了两对引物，引物序列见表1。引物验证结果见图1、2。通过对SMAD基因家族引物进行上述验证，确定SMAD1-1、SMAD2-1、SMAD3-1、SMAD4-2、SMAD5-1、SMAD6-1、SMAD7-1、SMAD8-2引物的扩增效率更高、特异性更强。

表1 SMAD基因家族PCR引物序列及扩增产物长度

2.2 SMAD1～SMAD8在非小细胞肺癌中的表达变化 将人正常支气管上皮BEAS-2B细胞采用Keratinocyte Supplementary Free Medium培养基在，37 ℃、5% CO2孵箱中孵育培养。人肺腺癌细胞系A549、H1299和肺鳞癌细胞系SK-MES-1用含有10% FBS、1%丙酮酸钠、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2孵箱中培养。应用TRIzol法提取各细胞的总RNA，M-MLV逆转录酶按照Takara试剂盒使用说明逆转录合成cDNA。所得cDNA置于-20 ℃保存。采用荧光实时定量PCR技术检测各细胞SMAD1～SMAD8 mRNA表达，所选引物分别为SMAD1-1、SMAD2-1、SMAD3-1、SMAD4-2、SMAD5-1、SMAD6-1、SMAD7-1、SMAD8-2。

图1 SMAD基因家族引物PCR扩增曲线

图2 SMAD基因家族引物PCR溶解曲线

以正常支气管上皮BEAS-2B细胞中SMAD1表达量为基准(校正RQ约为1)，SMAD2相对表达量为6.590±0.459、SMAD3为10.977±0.312、SMAD4为4.651±0.115、SMAD5为16.762±0.389、SMAD6为3.248±0.108、SMAD7为2.007±0.012、SMAD8为1.144±0.103，均较SMAD1表达升高，其中SMAD5表达最高，SMAD3次之。由此可以推测，SMAD5、SMAD3在正常支气管上皮细胞中可能具有维持细胞生物学稳定的功能。

SMAD2、SMAD4、SMAD5、SMAD6、SMAD7、SMAD8在肺腺癌A549、H1299细胞及肺鳞癌SK-MES-1细胞中的表达均较人正常支气管上皮BEAS-2B细胞降低；在H1299、SK-MES-1细胞中SMAD1表达较BEAS-2B和A549细胞增加，且在A549细胞中SMAD1表达较BEAS-2B细胞下降；在SK-MES-1细胞中SMAD3表达增加，且在H1299、A549细胞中SMAD3表达较BEAS-2B细胞下降；在H1299细胞中SMAD2、SMAD6、SMAD7表较其他三种细胞均下降；各细胞间比较P<0.05或<0.01。见表2。

表2 各种细胞中SMAD1～ SMAD8表达

3 讨论

PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性及敏感性高、操作简便、省时等特点。PCR扩增时需要引物。在准备设计基因引物前，要清楚地认识实验研究的目的和意义，通过查阅文献，明确该基因的相关研究理论；明确是否要进一步用于克隆或表达。如果需要克隆，引物5′端最好加上限制性内切酶的酶切位点，加入的酶切位点不能与引物内部形成互补结构，并且所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体的其他位置应尽量无该酶切位点。如此构建新的质粒时可供选择的内切酶空间更大，并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点，为日后研究该基因的后续实验奠定基础。目前，进行引物设计时模板选择有两种情况：一种是扩增已知基因，需要在Gene Bank数据库中搜索相同物种该基因的DNA或者mRNA作为模板来设计引物；另一种是扩增未知基因，需根据比较基因组定位的原理，选择研究深入的高等动植物保守的功能基因的DNA或者mRNA序列为模板来设计引物。虽然引物设计模板选择有很多种，但是无论何种情况，都要涉及引物设计软件。当前进行引物设计的国际三大核酸数据库分别为NCBI、DDBJ、EMBL，生物软件有BlockMaker、CodeHop、clustalW2、VectorNTISuit、Dnasis Omiga、Dnastar、DNAMAN、Oligo6.0等[1]。设计引物的软件一般均具有引物自动搜索功能，不同软件侧重点有所不同，自动搜索的结果也不同。一般以Premier Primer5.0功能最强且方便使用，其次是Oligo6.0。要想得到效果好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。本研究中我们采用以上方法成功设计出SMAD基因家族引物序列，通过对引物序列进行PCR扩增检测，根据溶解曲线、扩增曲线及琼脂糖凝胶电泳结果分析，选择在相同温度下，扩增曲线拟合度较一致且曲线定点斜率大，表示扩增效率高、特异性好的引物序列；溶解曲线拟合度较一致且溶解温度稳定，溶解曲线峰值较高，表示引物和扩增片段间能够很快解链并能够很快结合扩增，进而更能实现特异引物与目的基因模板序列间高效和特异扩增。琼脂糖凝胶电泳是对扩增产物的一种检测方法，根据目的片段基因CDS区碱基对的大小，可通过琼脂糖凝胶电泳的方法检测扩增片段的条带是否为我们所设计的目的基因片段，条带亮度也能判定扩增的目前基因的数量，间接反映扩增效率。结合以上设计分析过程，本研究成功设计并鉴定出扩增效率高、特异性高的针对目的基因SMAD基因家族的引物序列。

TGF-β/SMAD信号通路是一条重要的生物信息转导通路。TGF-β是一种重要的细胞因子，广泛参与细胞的分化、增殖、形态改变、黏附、转移及凋亡。TGF-β超家族成员通过膜受体介导将信号传入细胞内，其下游最主要的信号蛋白SMAD在细胞内通过不同的方式参与各种基因的表达调控。SMAD是将TGF-β信号传至细胞内发挥生物学效应的关键分子，参与细胞增殖、转化、合成、分泌、凋亡等一系列生物学功能。但目前TGF-β/SMAD信号通路在肺癌中的作用尚不十分清楚，SMAD基因家族在非小细胞肺癌中的表达变化及主要功能目前尚未见报道。

SMAD蛋白是在小鼠与人类细胞质中发现的一类蛋白质[2]，因果蝇中相对应的蛋白质名为Mad而得名。人SMAD基因位于15q22.31-q23及18q21.1染色体区域，现已发现SMAD蛋白家族包括SMAD1～9[3]。根据SMAD蛋白结构和功能不同可分为三类[4]：第一类是受体调节型SMAD蛋白(RR-SMAD)，是TGF-β家族受体激酶的直接底物；包括SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5、SMAD8、SMAD9。其中SMAD2、SMAD3分子C-末端具有特征性丝氨酸序列，可被活化的TRI磷酸化，决定了配体信号转导的特异性，是参与TGF-β信号转导的效应分子。研究发现，非小细胞肺癌组织SMAD2基因高表达会影响患者预后[5]；SMAD2蛋白对TGF-β1/SMAD3介导的肝纤维化具有保护作用[6]。第二类为共同调节型SMAD 蛋白(Co-SMAD)即SMAD4，可通过受体磷酸化的SMAD蛋白参与TGF-β、活化素和BMP的信号传导[7]。Co-SMAD是TGF-β/SMAD信号通路信息传递的共用分子[8]，在参与和调节TGF-β超家族后续信号转导方面必不可少。对于上皮组织起源的细胞，SMAD4蛋白核移位可直接诱导细胞凋亡，对于控制细胞的增殖可能起重要作用。由于SMAD4蛋白的C-端缺乏SSXS motif结构，SMAD4蛋白不结合也不受TGF-β刺激而发生磷酸化，但可结合或稳定其他SMAD复合体[9]，因此SMAD4是具有协同作用的蛋白，SMAD2、SMAD3与SMAD4 可协同诱导TGF-β并刺激其他基因的表达；同时将SMAD2与SMAD4的C-端截除得到的蛋白质则是TGF-β信号传递的抑制剂；另外研究发现，SMAD4也是肿瘤抑制候选基因，在乳腺癌、肺癌、甲状腺癌和胰腺癌中均发现其基因表达异常[10～12]。第三类是抑制型SMAD蛋白(I-SMAD)，包括SMAD6、SMAD7。SMAD7与SMAD泛素化调节因子(Smurf)共同参与SMAD4降解[13]；可募集Smurf至TGF-β受体，诱导TGF-β受体的降解，进而抑制TGF-β/SMAD信号转导通路的生物学效应[14]。SMAD7基因位于染色体18q21，属于抑制型SMAD，不能被受体磷酸化，但可与活化的TGF-β受体1牢固结合，阻止RR-SMAD磷酸化，从而对该超家族信号传递起负调控作用。SMAD7表达紊乱可影响细胞对TGF-β的应答。研究发现，在成人T细胞白血病和淋巴瘤中SMAD7表达上调[15]；在胃癌和甲状腺癌中也发现SMAD7表达上调[16,17]；提示SMAD7表达异常可促进肿瘤的发生。

本研究通过RT-PCR技术检测正常支气管上皮细胞系BEAS-2B，肺腺癌细胞系A549、H1299及肺鳞癌细胞系SK-MES-1中SMAD基因家族表达。结果发现，正常肺支气管上皮细胞中SMAD2、SMAD3、SMAD5基因高表达，SMAD5表达最高；在非小细胞肺癌细胞系中，肺腺癌A549细胞中SMAD基因家族表达情况较正常支气管上皮细胞SMAD基因家族表达水平普遍偏低，以SMAD5、SMAD8降低最为明显；上述结果提示，SMAD5可能在肺腺癌A549癌性转化过程中发挥关键性作用。在肺腺癌H1299、肺鳞癌SK-MES-1中同样发现SMAD5低表达，提示SMAD5可能参与肺癌的发生、发展。在肺鳞癌SK-MES-1细胞系中SMAD3高表达，而在正常支气管上皮中SMAD3已存在相对高表达，提示SMAD3可能与上皮相关性疾病相关。上述结果提示，SMAD基因家族在不同细胞系尤其是正常细胞和癌性细胞系中的表达变化具有明显的不同；在不同病理类型的肺癌细胞系中，SMAD基因表达变化与病理类型具有相关性。

本研究初步明确了人正常肺支气管上皮细胞向癌症方向发生、发展中变化明显的SMAD基因，为后续深入研究TGF-β/SMAD信号通路、肺癌发生、发展中的关键SMAD基因以及TGF-β/SMAD信号通路在肺癌发生中的具体作用提供了方向，也为Primer Bank引物序列数据库填补了检测SMAD基因家族的高效特异引物序列。