硼对大鼠脾脏淋巴细胞的毒性作用及增殖和凋亡的影响

裴亚琼，　张　倩，　胡倩倩，　李升和，　金光明，　靳二辉

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳　233100)

硼是自然界中广泛分布的一种矿物元素，其理化性质介于金属和非金属之间，对植物和动物机体均具有重要的生物学功能[1]。 相关研究证实，硼是植物必需微量元素，也是动物可能的必需微量元素之一[2]。当硼缺乏或者摄入不足，可引起动物生殖系统及免疫系统的损伤[3]。然而，适量的补充硼则能够抑制肿瘤细胞的生长，对宫颈癌、前列腺癌和其他癌症的治疗有很大有益作用[4-5]；研究证实，在基础日粮中添加适宜浓度的硼，能够显著提高猪的骨骼强度[6]。但是，硼过量摄入或者长期暴露，则对动物机体产生明显损伤甚至毒性作用。如Geyikoglu等研究结果显示，高剂量硼可使胸肌纤维内葡萄糖、糖原、乳酸和ATP等能量代谢产物浓度降低[7]；此外，饮水补充高剂量硼还可以损伤大鼠的胰腺和肾上腺组织结构，抑制胰腺和肾上腺的生长发育[8-9]。

对免疫系统的研究也发现，饮水添加 100 mg/ L硼对3～6周固始鸡免疫器官的发育有明显促进作用，而添加高剂量硼 (大于200 mg/L)则有明显抑制甚至毒性作用，表现为中枢免疫器官中淋巴细胞急剧减少，器官重量明显降低，组织结构出现异常，同时外周免疫器官的组织结构也出现明显损伤，发育受阻[10]。江妍等研究发现，饮水补充10～40 mg/L的硼能够增加60 d大鼠脾脏重量和器官指数，表现为增大脾小结面积和动脉周围淋巴鞘厚度，使脾索增粗，脾窦变窄，淋巴细胞数量增加；而添加480和640 mg/L硼可显著降低60 d大鼠脾脏重量与器官指数，造成脾脏组织结构模糊[11]。综上所述，不同剂量硼对免疫器官的发育及其免疫功能产生了明显不同的作用，但这种作用是如何产生的，其影响机制是什么，仍不清楚。因此，本文选用大鼠脾脏淋巴细胞为试验对象，通过体外添加不同剂量硼酸研究其对淋巴细胞的毒性作用及增殖和凋亡的影响，为揭示硼影响免疫器官发育的作用机制提供依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1试验动物饲养试验选用清洁级SD雄性大鼠(2月龄)，购自于南京青龙山实验动物繁殖场。大鼠饲养于全膜终端独立通气笼盒(IVC)内，严格按照IVC标准进行饲养。环境温度25～27 ℃，湿度55～63%，光照14 h。饲喂颗粒饲料及蒸馏水，自由饮水和采食。大鼠颗粒饲料(许可证号：SCXK(浙)2014-001)的营养水平。购自于南京青龙山实验动物繁殖场。其营养成分为：粗蛋白≥18.15%，粗脂肪≥4.03%，粗纤维≥5.12%，粗灰分7.94%，钙1.43%，磷0.87%，硼1.96 mg/kg。

1.1.2主要试剂Hank's溶液(HyClone 中国，批号AB10165471)；RIPM-1640(HyClone中国，批号AB10128297)；红细胞裂解液(biosharp中国，批号BL503A)；青链霉素(biosharp中国，批号6607731)；胎牛血清(Solarbio中国，批号S9040)；硼酸为分析纯，纯度≥99.5%，硼含量≥17.4%(国药集团化学试剂有限公司，批号20120524)； MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(博士德中国生物工程有限公司，批号AR1156)；Cell-Counting Kit-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)博士德中国生物工程有限公司，批号AR1160-100)；CellTrase CFSE(invitrogen中国，批号C34554)；细胞凋亡试剂盒(美国BD公司，批号556547)。

1.2　方法

1.2.1大鼠脾脏淋巴细胞分离大鼠经乙醚麻醉后颈椎脱臼致死，于超净工作台上打开胸腔，无菌取出脾脏；剪去表面脂肪及白膜，眼科剪剪碎脾脏，用无菌注射器内芯小心研磨后，经200目的尼龙筛过滤；用Hank's溶液洗涤细胞沉淀2次，加入红细胞裂解液4 ℃裂解2～3 min，再分别用Hank's溶液和RIPM-1640洗涤裂红后的细胞沉淀，离心弃上清抽取中层细胞，将细胞重悬于新鲜的1640完全培养基(含5%胎牛血清及 0.5%青链霉素)中即为脾脏淋巴细胞。

1.2.2细胞毒性试验取2月龄雄性SD大鼠1只，无菌分离脾脏淋巴细胞，将分离得到的脾脏淋巴细胞制备成单细胞悬液，在细胞瓶中培养至对数增长期，调整细胞悬液浓度为104/ mL加入96孔板，分为试验I-XIII组，分别加入0.1、0.2、0.4、0.8、1、2、4、8、10、20、40、80、100 mmol/L的硼酸处理(硼酸浓度为计算值，下同)，同时设置对照组及空白组，对照组只加细胞悬液不加药物处理，空白组只加细胞培养液，每组设置5个重复孔，二氧化碳培养箱继续培养24 h后， 按照MTT和Cell-Counting Kit-8试剂盒要求进行后续操作，并计算淋巴细胞的抑制率与增殖率，抑制率=(样本OD值-空白OD值)/(对照OD值-空白OD值)，增殖率=1-抑制率。

1.2.3淋巴细胞增殖和凋亡检测取2月龄SD雄性大鼠1只，无菌分离脾脏淋巴细胞，将分离得到的脾脏淋巴细胞制备成单细胞悬液，调整浓度为10.6/ mL加入24孔板，根据细胞毒性试验结果，分为试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅺ和Ⅻ组，分别加入0.4、1、2、4、40、80 mmol/L的硼酸，同时设置对照组，对照组只加细胞悬液不加药物处理，每组设置3个重复孔，二氧化碳培养箱继续培养24 h后，按照CFSE和凋亡试剂盒说明进行后续处理，并上流式细胞仪检测，然后用FLOWJO 7.6.0软件分析试验结果。

2　结果

2.1　硼的细胞毒性作用

MTT法检测硼对脾脏淋巴的毒性作用(图1a和图2a)。由图1a可知，试验II～VII组脾脏淋巴细胞抑制率与对照组相比均明显降低，其中试验III组显著降低27.8%(P<0.05)，而试验X～XIII组抑制率分别极显著升高38.60%、52.00%、72.40%和77.20%(P<0.01)。由图2a可知，试验II～VII组淋巴细胞增殖率与对照组相比明显升高，其中试验III组显著升高27.80%(P<0.05)，而试验VIII～XIII组增殖率明显降低，其中试验X～XIII组分别极显著降低了38.60%、52.00%、72.40%和77.20%(P<0.01)。

CCK-8法检测硼对脾脏淋巴的毒性作用(图1b和图2b)。由图1b可知，试验II和III组脾脏淋巴细胞抑制率与对照组相比明显降低，但差异不显著(P>0.05)，而IV和IX组抑制率显著升高32.30%和30.20%(P<0.05)，试验X、XI、XII、XIII组抑制率分别极显著升高60.70%、74.80%、69.70%和84.70%(P<0.01)。由图2b可知，试验II和III组脾脏淋巴细胞增殖率与对照组相比有所升高，但差异不显著(P>0.05)，而X～XIII组与对照组相比分别极显著降低53.00%、69.20%、73.20%和83.40%(P<0.01)。

图1　硼对脾脏淋巴细胞的抑制率的影响

图2　硼对脾脏淋巴细胞增殖率的影响

2.2　硼对脾脏淋巴细胞增殖与凋亡的影响

不同浓度硼对淋巴细胞增殖的影响(图3a)。图3a最右边的峰代表母代细胞，其左边各峰依次代表不同的子代细胞，子代峰的数量越多、面积越大、高度越高表示荧光强度越强，说明细胞增殖明显，反之则说明增殖受阻。试验III组子代细胞峰值最高，面积最大 ，说明荧光强度最强，增殖最多(图3a-C)；试验XI和XII组的子代细胞荧光强度较对照组显著降低，其中试验XII组的峰值最低，面积最小，说明增殖最少(图3a-G和H)。不同浓度硼对淋巴细胞增殖率的影响(图4a)。与对照组相比，试验II、III、V、VI和VII组的增殖率明显升高，其中试验Ⅲ组极显著升高10.60%(P<0.01)，而试验XI和XII组的增殖率则是极显著的降低8.80%和9.10%(P<0.01)。

不同浓度硼对淋巴细胞凋亡的影响(图3b)。由图3b可知，图中Q1代表细胞碎片，Q2代表凋亡晚期的细胞，Q3代表凋亡早期的细胞，Q4代表活细胞，其中Q2和Q3统称为凋亡细胞。试验Ⅲ组的活细胞数明显在所有组中最多，而凋亡象限中的细胞数量最少(图3b-C)；而Ⅺ和Ⅻ组的活细胞数量明显减少，凋亡细胞数量明显增多(图3b-G和H)。不同浓度硼对淋巴细胞凋亡率的影响(图4b)，与对照组相比，试验Ⅱ、Ⅲ和Ⅺ组脾脏淋巴细胞凋亡率明显降低，其中试验Ⅲ组的凋亡率显著降低5.60%(P<0.05)，而试验Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ和Ⅻ组的凋亡率明显升高，其中Ⅺ和Ⅻ组分别极显著升高5.80%和18.20%(P<0.01)。

图3　硼对脾脏淋巴细胞增殖和凋亡的影响

图4　硼对脾脏淋巴细胞增殖率与凋亡率的影响

3　结论与讨论

3.1　适量的添加硼可对脾脏淋巴细胞产生有益作用

脾脏是动物机体重要的外周淋巴器官，具有造血、滤血、清除衰老的血细胞及参与免疫反应等功能，同时也是免疫应答的主要场所，机体内大多数的体液免疫和细胞免疫都是在脾脏内完成的[12]。脾脏免疫功能的正常发挥与其生长发育和组织结构密切相关，而脾脏则是由大量的淋巴细胞组成的，因此可以说，脾脏生长发育的优劣取决于脾脏内淋巴细胞的增殖和凋亡。研究发现，饮水补充20和40 mg/L硼不仅可升高血清IgG水平、血红蛋白含量及白细胞、红细胞、淋巴细胞和单核细胞数，引起脾脏免疫细胞CD3+T细胞数量增多，增强机体的非特异性和特异性免疫反应，而且还能増加脾脏的CD4+T细胞数和CD4+/ CD8+T细胞比值，促进脾脏合成分泌白介素IL-2、干拢素IFN-γ和IL-4，增强机体的细胞免疫功能[13]。本研究也发现，体外培养淋巴细胞时，添加0.2 mmol/L 和0.4 mmol/L的硼酸，可以明显提高脾脏淋巴细胞的增殖率;其中添加量为0.4 mmol/L时，可以显著促进淋巴细胞的增殖。这可能是因为硼对动物机体的细胞膜功能和酶促反应均起着着重要的作用，适量的补充硼，可以增强淋巴细胞细胞膜的功能及相关酶的活性[14]，从而加快细胞的分裂，使增殖率升高；同时，还有研究表明，硼可以诱导细胞分裂增殖相关基因的RNA转录，增加RNA含量，促进相关蛋白的表达，进而刺激脾脏淋巴细胞的增殖[15]。

3.2　高剂量的添加硼则对脾脏淋巴细胞产生毒性作用

与其它的微量营养元素的作用类似，硼对动物机体的影响呈“U”型曲线，适宜浓度的硼可以促进组织器官的发育，但超过一定剂量时，组织、器官因达到而授极限则会对机体产生有害的影响[16]。研究发现，饮水添加硼160～320 mg/L对大鼠胸腺组织结构及细胞免疫功能有一定不良影响，当硼添加量达到640 mg/L时，大鼠胸腺的发育、组织结构及胸腺内的淋巴细胞增殖分化均受到明显的抑制[17]。本研究也发现，当添加量达到20 mmol/L以上时，淋巴细胞的抑制率显著升高，凋亡率也开始显著上升，对细胞的毒性作用明显增强；当添加量达到100 mmol/L时，毒性作用最为显著。这可能是因为高硼改变了培养液的pH影响了细胞膜的功能，从而影响了细胞内各项酶的活性，因此对细胞产生了毒害作用[18]，使凋亡率升高。也有研究证实，长期的硼压力(640 mg/L)能够通过TLR3/4通路加速胸腺细胞的更新和死亡，TLR活性的降低可能促使硼应激下的免疫抑制作用[19]，这也能使得淋巴细胞的凋亡率升高。此外，硼对一些大分子物质的代谢也能起到作用。有报道指出，硼可以通过调节NAPHD的生成来调节胰岛素的释放，并通过影响胰岛素、甲状腺激素和肾上腺素的水平来影响糖类、脂类和蛋白质的代谢[20-22]。所以，高剂量的硼能使得淋巴细胞的代谢功能受到抑制，从而加速细胞的凋亡。

综上所述，当体外培养大鼠脾脏淋巴细胞添加0.4 mmol/L的硼酸时，可以显著促进脾脏淋巴细胞的增殖，对淋巴细胞的生长有明显的促进作用；但是当添加量达到20 mmol/L时，则对淋巴细胞产生了明显的毒害作用，不利于其生长发育。