新疆野山杏总黄酮对小鼠镇痛作用考察

谷虹霏，戴小华，阿依姑丽·艾合麦提，贾楠楠，张少鹏，杨若蓝

(新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆　乌鲁木齐　830052)

野山杏具有丰富的营养价值和广泛的药理学功效，含有多种黄酮类化合物，这是近年来被广为关注的天然产物之一。大量研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化[1]、降血脂[2]、抗炎[3]、镇痛[4]、保肝[5]和抗肿瘤[6]等多种药理作用。黄酮类化合物与化学合成药物相比毒性较小，与吗啡和阿司匹林的作用机制不同，是一类新型的镇痛药物[7]。有研究表明,小叶榕叶总黄酮[8]也具有良好的镇痛作用，对缓解疼痛疾病的治疗具有重要意义。

本研究在张华[9]和刘江波[10]的研究基础上以新疆野山杏为材料，采用有机溶剂超声提取法及大孔吸附树脂纯化法，纯化新疆野山杏总黄酮；通过建立小鼠疼痛模型[11-12]，对新疆野山杏总黄酮的镇痛作用进行考察，为进一步开发新疆野山杏的药用价值提供科学依据。

1　材料与方法

1.1　材料及试剂

野山杏果肉(采自新疆哈密伊吾县)；芦丁标品(上海源叶生物科技有限公司)；醋酸(辽宁东宁药业有限公司)；阿司匹林(BJ-27466，拜耳医药保健有限公司)；生理盐水(石家庄四药有限公司)；无水乙醇、甲醇、亚硝酸钠、硝酸银、氢氧化钠(天津市致远化学试剂有限公司)。

昆明种小鼠由新疆医科大学动物中心提供，许可证号为SYXK-新2003-0001。

1.2　设备与仪器

超声波药品处理机(JBT/C-YCL400T/3P(D,济宁金百特工程机械有限公司)；旋转蒸发器(RE-52B，上海亚荣化仪器厂)；可见分光光度计(723，上海欣茂仪器有限公司)；循环水多用真空泵(SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司)；数显恒温水浴锅(HH-S，江苏省金坛市医疗仪器厂)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9246A，上海精宏实验设备有限公司)；电子天平(SL202N，上海民桥精密科学仪器有限公司)；智能热板仪(RB-200，成都泰盟科技有限公司)。

1.3　实验方法

1.3.1样品制备

张均、张垍为唐朝玄宗时期的宰相张说之子，颇受唐玄宗器重，分别在朝中担任过重要官职。张均为张说长子，曾任大理寺卿一职；张垍为张说次子，为当朝驸马。二人在安史之乱中投靠于安禄山，并分别在其军中担任伪中书令、宰相之职。安史之乱被平定之后，二人结局或死或发配。但究竟孰死孰生，《资治通鉴》记载与《旧唐书》《新唐书》《册府元龟》记载并不相同。

取一定量的野山杏果实干燥、粉碎，过40目筛，加50倍量体积分数 50%乙醇超声1 h，提取2次，抽滤，合并滤液，旋转蒸发，大孔树脂纯化干燥后得野山杏总黄酮。用生理盐水将野山杏总黄酮配制为所需的浓度，4℃保存备用[1]。

1.3.2动物准备

昆明种小鼠100只，体质量(21±2)g，雌雄各50只。实验前小鼠适应性喂养1周，挑选饮水、进食以及活动正常的小鼠纳入实验。

1.3.3野山杏总黄酮的含量测定

1.3.3.1芦丁标准曲线的制作

称取芦丁标准品20.00 mg于棕色容量瓶中，用60%乙醇溶液定容至100 mL，摇匀，得到浓度为0.20 mg/mL的芦丁标准品溶液。分别吸取芦丁标准品溶液0.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00 mL，分别置于25 mL 棕色容量瓶中，分别滴加50 g/L亚硝酸钠溶液0.7 mL，混匀，静置6 min，再分别滴加100 g/L硝酸铝溶液0.7 mL，混匀，静置6 min，再加40 g/L氢氧化钠溶液5 mL，最后用甲醇定容至25 mL，摇匀，放置10 min。取配制好的芦丁标准溶液1 mL，在UV2550紫外分光光度计510 nm处测定吸光度，以吸光值A为纵坐标、芦丁浓度C为横坐标，绘制芦丁标准曲线[1]。

1.3.3.2含量测定

称取“1.3.1”制备的样品20.0 mg，用60%乙醇溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中。吸取2 ml配制好的样品溶液于25 mL棕色容量瓶中，按照芦丁标准曲线的绘制方法分别滴加50 g/L亚硝酸钠溶液0.7 mL、40 g/L氢氧化钠溶液5 mL、100 g/L硝酸铝溶液0.7 mL，最后用60%乙醇定容至刻度线，摇匀。在510 nm处测定野山杏总黄酮的吸光度，每组平行测3次，根据吸光度并结合标准曲线计算得到总黄酮含量[1]。

1.3.4小鼠醋酸扭体实验

取50只雌雄各半的昆明种小鼠，按每组10只随机分为高剂量组(15 mg/kg)、中剂量组(11 mg/kg)、低剂量组(7.5 mg/kg)、阳性对照组(阿司匹林10 mg/kg)、空白对照组(生理盐水)。野山杏总黄酮、阿司匹林和生理盐水为小鼠灌胃给药，每日给药1次，连续3天，第3天给药前12 h禁食，不禁水。第3天给药30 min后，以1%醋酸溶液0.2 ml 皮下注射，30 min后记录小鼠10 mim内扭体次数，以此作为痛阈指标[11]。药物对扭体反应的抑制率为：

1.3.5小鼠热板致痛实验

取50只雌性昆明种小鼠，按每组10只随机分为高剂量组(15 mg/kg)、中剂量组(11 mg/kg)、低剂量组(7.5 mg/kg)、阳性对照组(阿司匹林10 mg/kg)、空白对照组(生理盐水)。将小鼠放置在恒温55℃的热板上，以小鼠出现舔足反应的时间作为痛阈指标，其中舔足反应为热刺激小鼠足部产生疼痛的反应。实验前筛选痛阈5～30 s者为合格实验鼠，给药前测定小鼠舔足反应时间2次，2次测量间隔5 min，取其平均值作为基础痛阈。野山杏总黄酮、阿司匹林和生理盐水为小鼠灌胃给药，每日给药1次，连续3天，第3天给药后10、30、60 min测定痛阈指标[12]。

1.3.6小鼠温浴甩尾实验

取50只雌雄各半的昆明种小鼠，按每组10只随机分为高剂量组(15 mg/kg)、中剂量组(11 mg/kg)、低剂量组(7.5 mg/kg)、阳性对照组(阿司匹林10 mg/kg)、空白对照组(生理盐水)。将小鼠尾尖浸入48℃恒温水中约5 cm，以小鼠出现甩尾反应的时间作为痛阈指标，其中甩尾反应指热刺激小鼠尾部产生疼痛的反应。实验前预选痛阈5～30 s者为合格实验鼠，给药前测小鼠舔足反应时间2次，2次测量间隔5 min，取其平均值作为基础痛阈。野山杏总黄酮、阿司匹林或生理盐水为小鼠灌胃给药，每日给药1次，连续3天，第3天给药2 h后测定每只小鼠热板致痛实验的痛阈指标[11]。

1.4　数据分析

实验数据用Excel进行处理，数据分析用SPSS19.0进行分析，采用单因素方差分析。

2　结果

2.1　芦丁标准曲线

由图1可知，芦丁标准曲线的线性回归方程为：A=11.162C+0.012 2(R2=0.999)，说明在0.016～0.072 mg/mL的范围内芦丁质量浓度C与吸光度A之间有良好的线性关系。

图1　芦丁标准曲线

2.2　野山杏总黄酮的含量

在UV2550紫外分光光度计510 nm处测定野山杏总黄酮的吸光度，每组平行3次测定，取平均值。根据测定的吸光度值结合标准曲线，计算得出总黄酮含量为817 mg/mL。

2.3　野山杏总黄酮对小鼠醋酸扭体反应的影响

各剂量组对小鼠扭体反应的抑制情况见表1。与空白对照组比较，野山杏总黄酮低、中、高剂量组和阳性对照组均具有极显著性差异(P<0.01)，其中野山杏总黄酮低、中、高剂量组疼痛抑制率分别为16.57%、26.12%、51.68%。结果表明,野山杏总黄酮低、中、高剂量组和阳性对照组均能明显减少醋酸致痛模型中小鼠扭体次数，具有一定的剂量依赖性，随着剂量增大，抑制疼痛作用越强。

表1　不同剂量野山杏总黄酮对醋酸致小鼠扭体反应的影响

注：与空白对照组比较，**P<0.01

2.4　野山杏总黄酮对小鼠热板舔足反应的影响

如表2所示，与空白对照组比较，野山杏总黄酮高、中、低剂量组均可明显延长小鼠舔足反应时间，抑制小鼠的疼痛舔足反应，具有明显镇痛作用。其中，野山杏总黄酮的高、中剂量组在60 min内均具有明显延长热板法致痛模型中小鼠痛阈的作用(P<0.01)。

表2　不同剂量野山杏总黄酮对热板致小鼠舔足反应的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.5　野山杏总黄酮对小鼠温浴甩尾反应的影响

如表3所示,野山杏总黄酮野山杏总黄酮低、中、高剂量组和阳性对照组与空白对照组相比,均明显延长小鼠甩尾反应时间(P<0.01)。野山杏总黄酮的低剂量对热板致痛的小鼠痛阈具有一定的抑制作用，野山杏总黄酮的高剂量可明显延长温浴致痛模型中小鼠的痛阈(P<0.01)，具有显著的镇痛作用。

表3　不同剂量野山杏总黄酮对温浴致小鼠甩尾反应的影响

注：与空白对照组比较，**P<0.01

3　讨论

野山杏总黄酮是从野山杏果肉中提取的有效成分,且总黄酮大多具有抗炎、镇痛等药理作用。张蓓蓓等[7]研究表明，滁菊总黄酮的镇痛作用机制可能与促进血清和脑组织中NO的释放，抑制其前列腺素E2的生成有关，其中可能有部分中枢机制参与。因此本实验采用热板致痛法、温浴致痛法和扭体致痛法3种不同类型经典小鼠疼痛模型[11-12]，观察新疆野山杏总黄酮的镇痛作用。其中，热板致痛法、温浴致痛法属于热刺激，代表的是小鼠躯体体表痛，而醋酸致痛法则属于化学刺激，代表的是小鼠体内内脏痛。热板致痛法、温浴致痛法引起的是急性疼痛，而醋酸致痛法引起的是紧张性的病理性疼痛[13-14]。热板致痛法和温浴致痛法主要利用小鼠足趾和尾部对热刺激十分敏感的特点，小鼠主要表现为舔足，甩尾，缩尾等反应；醋酸致痛法将醋酸注入小鼠腹腔，引起腹膜炎，诱导产生病理性疼痛，以此来考察新疆野山杏总黄酮的镇痛作用。

在本实验中，野山杏总黄酮高、中、低剂量组均对醋酸致小鼠疼痛扭体反应有明显的抑制作用。这与余行等[15]研究中大叶紫珠总黄酮高、中、低剂量组均具有明显镇痛作用的研究结果一致。野山杏总黄酮高、中、低剂量组均可显著延长热板致小鼠疼痛舔足反应时间，具有明显提高小鼠舔足反应痛阈的作用。这与俸婷婷等[16]研究桑白皮总黄酮对热板致小鼠疼痛舔足反应无明显抑制作用的结论不一致。温浴致小鼠疼痛实验中，野山杏总黄酮高、中、低剂量组能明显提高小鼠甩尾反应痛域，特别是高剂量组作用明显。通过3种不同类型经典小鼠疼痛模型实验观察得出新疆野山杏总黄酮可明显抑制小鼠疼痛反应，随着剂量的增加，抑制作用越明显，痛阈相应提高，具有一定的剂量依赖性。野山杏总黄酮具有明显得镇痛作用，因此可以认为野山杏镇痛作用的有效成分是总黄酮，但具体的黄酮成分有待进一步研究。

由于热板法、温浴法同是热刺激的急性疼痛模型，在实验设计过程中，采用热板致痛小鼠疼痛模型观察小鼠给药后10 min，30 min，60 min后疼痛反应的痛阈提高率。温浴致痛小鼠疼痛模型观察给药2 h后疼痛反应的痛阈提高率。通过2种热刺激疼痛模型观察不同时间范围内野山杏总黄酮对小鼠疼痛反应时间和痛阈提高率的影响，由表2分析可知，在给药2 h后，热刺激致小鼠疼痛反应痛域呈先增长后降低的趋势，在30 min到60 min范围达到峰值。在热板致痛实验中，随着时间的增加，在给药10 min～30 min内，野山杏总黄酮高、中、低剂量组对小鼠舔足反应痛域提高幅度较大，30 min～60 min内，痛域提高幅度较小。然而本研究中新疆野山杏总黄酮纯化后纯度较高，镇痛作用显著，小鼠疼痛模型实验中对小鼠灌胃新疆野山杏总黄酮药剂量设置有限，其最佳药效剂量和最佳药效作用时间还有待进一步研究确定。

综上所述，本实验考察了新疆野山杏总黄酮的镇痛作用，结果显示野山杏总黄酮具有显著的镇痛作用。但是在最佳药效作用时间和剂量以及其主要作用成分，还有待进一步研究。本研究为新疆本土特色资源开发利用提供研究基础，具有十分重要的意义。