条叶龙胆愈伤组织抗HepG-2活性研究

程玉鹏，王洪月，马爱萍，李弘琨，宁愿，姜丽丽，任朋英

(黑龙江中医药大学，黑龙江　哈尔滨　150040)

龙胆科(Gentianaeeae)龙胆属(Gentiana)植物条叶龙胆(GentianamanshuricaKitag.)为多年生草本植物。2015版《中国药典》[1]收录条叶龙胆入药部位为干燥根及根茎,在我国内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁、贵州等地产量较多，朝鲜、日本等地也有分布。龙胆中主要含龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、三叶苷、龙胆碱和龙胆多糖等化学成分。现代药理学研究表明， 龙胆提取物不但具有抗氧化、抗水肿[2-3]、抗菌[4-5]、镇痛、降血脂，抗炎、保肝及健胃利胆等作用[6]，同时也具有抗肿瘤、抑制癌细胞生长的作用[7]。

由于龙胆为多年生草本植物，近年环境又不断的恶化，野生龙胆资源已匮乏，目前正努力寻找其他途径去开发龙胆资源，其中通过组织培养技术获得药用资源是解决该问题的有效方法。因其具有生长速度快、易于大规模培养和易于有效成分的分离提取等优点，因而成为药用植物资源最有前景的替代资源[8]。本课题主要研究对条叶龙胆的组培体系(愈伤组织)进行提取，用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇及水进行分层萃取，确定其体外抗肝癌的有效部位。

1　材料

1.1　仪器

DL-CT-2NDIA超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；RT-6000酶标分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)；IL-185VT CO2培养箱(STIK)；荧光倒置显微镜(Germany leica instrument co.， Ltd)；移液器(Thermo Scientific)。

1.2　试药

无水乙醇(天津市致远化学试剂有限公司)；噻唑蓝(MTT，Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)；DMEM培养基(Hyclone)；胎牛血清(Biological industries)；青霉素-链霉素溶液(上海碧云天生物技术有限公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，上海星科生物科技有限公司)；胰酶细胞消化液(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3　细胞株

人肝癌细胞HepG-2细胞购买于ATCC细胞库。

1.4　愈伤组织

经本实验室分子鉴定和哈尔滨师范大学王臣教授形态学鉴定该样品来自龙胆科植物条叶龙胆(GentianamanshuricaKitag.)。

2　方法

2.1　条叶龙胆愈伤组织继代培养

MS固体培养基按照30 g/L加入蔗糖，再分别加入已配置好的激素母液，浓度分别为：6-BA 0.5 mg/L，2， 4-D 2.0 mg/L，KT 0.5 mg/L。选取培养3周长势良好的愈伤组织进行转接继代。

2.2　条叶龙胆愈伤组织萃取物的制备

收集培养3周的条叶龙胆愈伤组织，去除愈伤组织表面的培养基，将愈伤组织于恒温50℃烘干至恒重。分别精密称取5.0 g条叶龙胆愈伤组织粉末装入圆底烧瓶中，按照1∶40料液比加入70%乙醇，回流提取连续2次，每次2 h。常压过滤，收集滤液，将滤液置于50℃烘箱中烘干，得到龙胆愈伤组织乙醇提取物。将得到的龙胆愈伤组织乙醇提取物加适量蒸馏水成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取。萃取后得到的溶液置于烘箱挥发溶剂，得到石油醚层提取物、乙酸乙酯层提取物、水饱和正丁醇和水层萃取物。制成粉末于离心管中,-20℃储藏备用。

2.3　MTT法检测条叶龙胆愈伤组织萃取物对HepG-2细胞的作用

2.3.1阳性药物给药浓度的确定

取对数期肝癌细胞HepG-2，消化并收集细胞悬液，用血球计数板计数，用含10%胎牛血清和1%双抗的培养基调整细胞浓度至1×106个/mL，按照每孔100 μL的量分别接种于96孔板内，5% CO2、37℃培养过夜，待细胞贴壁后吸取上清，加入100 μL无血清培养基配置的阳性药紫杉醇。按照浓度2、4、8、16、20、30 μg/mL给药，阴性对照组只加入含0.1% DMSO的无血清培养基，每个浓度4个复孔，培养24 h后，每孔加入MTT(浓度为5 mg/mL)10 μL，使其终浓度为0.5 mg/mL，37℃孵育4 h，弃上清，每孔加入100 μL DMSO，振荡混匀，490 nm处检测OD值，实验重复3次。

2.3.2条叶龙胆愈伤组织萃取物的检测

实验分组：阳性对照组、阴性对照组和给药组(不同浓度)，每组4个复孔。其中阳性对照组加入100 μL IC50所对应的紫杉醇浓度溶液，阴性对照组只加入含0.1% DMSO的无血清培养基，给药组分别加入100 μL含有不同浓度(DMSO终浓度<0.1%)无血清培养基配置的条叶龙胆愈伤组织石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇及水萃取物。根据前期实验结果，对肝癌细胞HepG-2给药浓度为5、10、20、40、80、160 μg/mL，其余操作同上。实验重复3次。

细胞生长抑制率按照如下公式计算：

抑制率(%)=(OD对照组-OD实验组)/OD对照组×100%

2.4　统计学处理

实验数据以(mean±SD)表示。采用SPSS22.0软件对结果进行单因素方差分析和Dunnett检验。P≤0.05为具有显著性差异；P≤0.01为具有极显著性差异。

3　结果

3.1　紫杉醇对肝癌细胞HepG-2的抑制作用

结果见图1，紫杉醇对肝癌细胞HepG-2的抑制作用与给药浓度和时间呈正相关，具有一定的依赖性，IC50值为17.28 μg/mL。

图1　紫杉醇对肝癌细胞HepG-2的抑制作用注：空白对照组：DMSO<0.1%，抑制率(%)=0；与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.2　条叶龙胆愈伤组织萃取物对HepG-2细胞的体外增殖抑制作用

结果如图2所示，条叶龙胆愈伤组织石油醚、乙酸乙酯萃取物对体外培养的HepG-2细胞均具有显著的增殖抑制作用，且呈现良好的浓度-效应依赖关系，IC50分别为62.83 μg/mL和 73.06 μg/mL。而条叶龙胆愈伤组织的水饱和正丁醇及水萃取物的活性则较差，无明显抑制细胞作用。

图2　条叶龙胆愈伤组织萃取物对肝癌细胞HepG-2的抑制作用注：空白对照组：DMSO<0.1%，抑制率(%)=0；与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01

4　讨论

生长过快或是无限生长是肿瘤发生发展的特征之一，抑制肿瘤细胞生长，是抗肿瘤的有效办法[9-11]。龙胆作为传统的保肝药物，现代药理药效学研究证实其具有抗癌的作用[12]。组培体系易于大规模培养，易提取，且充分保留活性成分等优点，为资源短缺问题提供解决办法。MTT法因其经济且灵敏度高，已广泛用于检测生物活性因子，大规模筛选抗种瘤药物及测定肿瘤放射敏感性等领域。本实验通过MTT法，考察评价了条叶龙胆愈伤组织萃取物体外抗肿瘤活性，以对HepG-2细胞具有很好抑制作用的紫杉醇为阳性对照药，IC50值为17.28 μg/mL，条叶龙胆愈伤组织石油醚、乙酸乙酯萃取物与阳性对照药相比，对HepG-2细胞的抑制作用稍弱，IC50分别为62.83 μg/mL和73.06 μg/mL，但是二者对肝癌细胞的抑制率呈现良好的剂量-效应依赖关系，在紫杉醇资源日益短缺的今天，龙胆萃取物也同样具有抗肿瘤效果。虽然水饱和正丁醇和水萃取物也对HepG-2具有一定抑制作用，但效果不明显,且不成量效关系。故确定条叶龙胆愈伤组织石油醚、乙酸乙酯萃取物为抗肿瘤有效部位，其抗肿瘤作用的有效单体化学成分及其结构修饰、作用的分子机制等有待进一步深入研究。