一测多评法测定血塞通胶囊中5种皂苷类成分的含量

2018-07-12姜志远刘世萍马妍妍李业雨

中医药信息 2018年4期

姜志远，刘世萍，马妍妍，李业雨

(1.黑龙江省农垦总局疾病预防控制中心，黑龙江　哈尔滨　150090；2.哈尔滨医科大学附属第一医院，黑龙江　哈尔滨　150001)

血塞通胶囊是五加科植物三七药材经煎煮、大孔树脂分离获得的有效成分——三七总皂苷，加入适量的赋形剂制成的胶囊剂。血塞通胶囊具有活血祛瘀、通脉活络的功能，临床上常用于治疗中风偏瘫，心脉瘀阻引起的胸痹心痛、脑梗塞等病症。为了全面提升药品的质量标准，实现血塞通胶囊的多种成分质量评价，需要大量的化学对照品；由于三七皂苷类成分的分子结构和理化性质极为相似,分离成本较高，价格较贵，所以血塞通胶囊多种成分的质量评价在实际生产中很难推广。本实验选择血塞通胶囊中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd为含量指标, 以价廉易得的人参皂苷Rg1为参照物, 建立血塞通胶囊皂苷类成分的一测多评法[1-2]，实现5种成分同步测定, 从而降低检测成本, 提高药品检验的质量和效率,为血塞通胶囊的多指标检测提供了参考方法和理论依据。

1　仪器与试剂

1.1　药品试剂

血塞通胶囊(哈尔滨珍宝制药有限公司，批号20170102、20170103、20170104、20170201、20170202、20170203),成分为三七总皂苷,每粒装0.18 g(含三七总皂苷100 mg)；对照品三七皂苷R1 (批号110745-201619)、人参皂苷Rg1(批号110703-201731)、人参皂苷Re(批号110754-201626)、人参皂苷Rb1(批号110704-201726)、人参皂苷Rd(批号111818-201001)均购于中国食品药品检定研究院；乙腈(色谱纯，Merck公司)；实验用水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2　仪器设备

Agilent 1100型高效液相色谱仪，配有四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器；SHIMADZU LC-2010AHT型液相色谱仪(日本岛津)；YMC-Pack C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱、Phemomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱、Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；BS210S型电子天平 (北京赛多利斯天平有限公司)；KQ-600型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q A10型超纯水系统(默克密理博公司)。

2　方法与结果

2.1　一测多评方法学考察

2.1.1色谱条件[3-5]

YMC-Pack C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相为乙腈-水, 梯度洗脱(0～25 min,20%乙腈；25～50 min,20%～46%乙腈；50～60 min,46%～55%乙腈；60～65 min,55%乙腈) ；流速1.5 ml/min；柱温25 ℃；检测波长203 nm；进样量10 μl。皂苷的混合对照品和血塞通胶囊的HPLC图见图1。

图1　皂苷混合对照品(A)和血塞通胶囊(B)HPLC图

2.1.2皂苷混合对照品溶液的制备

精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等5种对照品适量，加甲醇制成每1 ml中含0.304 5 mg三七皂苷R1、1.193 6 mg人参皂苷Rg1、0.206 4 mg人参皂苷Re、1.532 4 mg人参皂苷Rb1、0.297 8 mg人参皂苷Rd的皂苷混合溶液，即得。

2.1.3供试品溶液的制备

取血塞通胶囊内容物约0.6 g，精密称定，置100 ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理(功率400 W，频率40 kHz)20 min，放置至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4线性关系考察

取“2.1.2项”下的皂苷混合对照品溶液，分别精密吸取2、4、6、8、10、12、15、20 μl，按“2.1.1项”下色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积(A)为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，进行线性回归。5种皂苷的线性考察结果见表1。

表1　血塞通胶囊中5种皂苷成分的线性关系

2.1.5精密度试验

精密吸取10 μl“2.1.2项”下的皂苷混合对照品溶液，按“2.1.1项”下色谱条件连续进样6针，记录5种皂苷类成分的峰面积,结果5种成分峰面积的RSD值分别为0.09%,0.11%,0.24%,0.17%,0.08%,表明仪器精密度良好。

2.1.6溶液稳定性试验

取本品，按“2.1.3项”下的制备方法制备供试品溶液，室温放置，在0 h、2.5 h、5 h、7.5 h、10 h、12.5 h、15 h、20 h、25 h分别进样10 μl，记录5种皂苷类成分峰面积。结果表明，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等5种皂苷成分峰面积的RSD值分别为0.44%，0.26%，0.86%，0.71%和0.23%，表明血塞通胶囊供试品溶液在25 h内的峰面积没有明显的变化，检测成分的稳定性良好，能够满足含量测定的需要。

2.1.7重复性试验

取本品，按“2.1.3项”下的方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1项”下色谱条件分别进样测定5种皂苷类成分的含量。结果表明，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等5种皂苷类成分的含量分别为44.32 mg/g，172.94 mg/g，19.61 mg/g，165.87 mg/g和42.54 mg/g, RSD值分别为0.83%，0.97%，0.94%，1.05%和0.97%, 结果表明该方法的重复性良好。

2.1.8加样回收率试验

取血塞通胶囊内容物约0.3 g，精密称定6份，置100 ml量瓶中，分别精密加入等量的皂苷混合对照品, 加入甲醇适量，按“2.1.3项”下方法制备供试品溶液。依法测定5种皂苷成分的含量并计算平均回收率。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等5种检测成分的平均回收率分别为101.96%，101.97%，101.28%，100.77%，101.35%；RSD值分别为0.35%，0.21%，0.20%，0.31%，0.17%，说明该方法的回收率较高，具有良好的准确度。

2.2　待测成分的相对校正因子

取“2.1.2项”下的皂苷混合对照品溶液，按“2.1.1项”下的色谱条件分别进样2、5、10、15、20、30 μl,测定5种皂苷类成分的峰面积。以人参皂苷Rg1为参照物,根据公式Fr=(An×Ws)/(As×Wn)分别计算三七皂苷R1、人参皂苷Re、Rb1、Rd等4种待测成分的相对校正因子,式中Fr、An、Ws、As、Wn分别为相对校正因子、参照成分的峰面积及其质量浓度(mg/ml)、待测成分的峰面积及其质量浓度(mg/ml)。结果见表2。

表2　血塞通胶囊中4种待测成分的相对校正因子计算结果表

2.3　校正因子的重复性考察

2.3.1不同检测仪器对相对校正因子的影响

考察Agilent 1100 、SHIMADZU LC-2010AHT等两种型号的液相色谱仪以及YMC-Pack C18、Phenomenon C18、Luna C18(规格均为250 mm×4.6 mm,5 μm)等3种色谱柱对血塞通胶囊的5种皂苷类成分相对校正因子的影响。结果表明，待测成分在不同色谱系统和色谱柱下的相对校正因子比较接近(RSD<3%)，重现性良好。结果见表3。

2.3.2待测成分色谱峰的定位

采用人参皂苷Rg1的保留时间相对值作为待测成分的定位标准, 计算不同色谱仪和色谱柱的相对保留时间。结果表明，在不同的色谱仪和色谱柱下，待测成分相对保留时间的数值比较接近(RSD<3%), 重现性较好。结果见表4。

表3　不同色谱仪和色谱柱测得的相对校正因子

表4　不同色谱仪和色谱柱测得的相对保留时间

2.4　样品的含量测定

按设定的含量测定方法，用一测多评法 (QAMS) 与外标法 (ESM)同时测定6批血栓通胶囊样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的含量，分别计算血塞通胶囊中5种皂苷类成分的含量。结果表明，两种含量测定方法测得的含量数据无显著差异(RSD<3%) 。结果见表5。

表5　血塞通胶囊中5种皂苷成分的含量测定比较结果表(mg/g)

3　讨论

3.1　色谱系统的选择

本实验参考了2015年版《中国药典》三七总皂苷的含量测定及参考文献[6-8]中皂苷类成分含量测定的方法,考察了甲醇-水系统、乙腈-水(磷酸溶液)系统等两种流动相体系对血塞通胶囊的分离效果, 结果显示乙腈-水系统的分离效果较好, 获得的HPLC图谱的基线平稳，色谱峰较多, 峰形较好，尤其是人参皂苷Rg1和Re可以达到基线分离，因此选择了乙腈-水系统。