产细菌素乳酸菌菌株的来源及所产细菌素的分类研究进展

刘 静，杨富民，白斌芳，郭 锌

（1.甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省食品检验研究院，甘肃 兰州 730030）

微生物代谢产物作为天然防腐剂的重要来源，因其低成本、短周期等优点而受到致力于开发安全无毒、抑菌范围广天然防腐剂科研工作者的青睐。细菌素作为具有抑菌活性的乳酸菌代谢产物，研究发现，其对很多导致食源性疾病的致病菌和腐败菌均具有抑制作用。实践证明，在各种微生物产生的细菌素中，由乳酸菌产生的细菌素是最具有防腐应用潜质的，故而引起了诸多研究者的关注，在食品储存和保鲜中多有应用。

目前，随着研究的深入，越来越多的细菌素被发现，已被鉴定的有Nisin、Lactacin、Lactocin、Helveticin、Fermenticin、Sakecin等，其中研究最早、最成熟的当属乳酸链球菌素即Nisin，其是目前得到许多国家认可并且已经应用于食品储存和保鲜中的天然食品防腐剂，我国于1992年将其列入相应的国标中，但后来研究发现，Nisin只能抑制由革兰氏阳性菌导致的食品腐败，对革兰氏阴性菌引起的腐败无能为力。因此继续发掘和筛选高效广谱的细菌素已然成为近年来科学家们努力的方向。

为了便于科研工作者更好的开发抑菌谱广、抑菌效果好的细菌素，本文在查阅文献资料的基础上，对产细菌素乳酸菌菌株的来源食品、菌株的所属种属、细菌素的分类以及分离纯化方法等做一评价，为相关的研究提供基础材料和参考，促进天然防腐剂的开发工作更好更快地开展。

1 产细菌素乳酸菌菌株的食品来源

产细菌素乳酸菌大多来源于发酵食品，包括动物性发酵食品（如牦牛酸奶、酸马奶、奶渣、奶酪、干酪、风干肠、火腿等）和植物性发酵食品（如泡菜、发酵蔬菜汁、醪糟、老陈醋等），此外也有分离自动物肠道和粪便及变质食品的。

1.1 产细菌素乳酸菌菌株的动物性发酵食品来源

目前，关于从传统动物性发酵食品中分离乳酸菌细菌素的报道多为乳制品，有分离自自然发酵牦牛奶制品的如牦牛酸奶[1]、奶酪、奶渣等，杨吉霞等[2]从牦牛奶酪中筛选出具有广谱抗菌性的Y13、X29和X30共3株乳酸菌；周佳等[3]从牦牛奶渣中分离出了对热很稳定的产细菌素肠球菌SAU-2；贺银凤等[4]从内蒙古地区酸马奶酒中分离出两株产细菌素肠球菌BY-3-2和SQ-3-2，经鉴定菌株BY-3-2为屎肠球菌（Enterococcus faecium），菌株SQ-3-2为耐久肠球菌（Entercoccus durans）；另外，干酪中也能分离乳酸菌细菌素，LOZO J等[5]从自然发酵的干酪中分离到的菌株Lacto bacillus paracaseisubsp.paracaseiBGBUK2-16，能够产生具有抑菌作用的细菌素，CARIDI A等[6]从来自于干酪和生羊奶的225株乳酸菌中分离到了1株Lb.paracasei，该菌对Escherichia coli有很强的抑制作用；研究表明，风干肠及火腿制品也能分离出乳酸菌细菌素[7]，刘丽等[8]从一种火腿制品中分离筛选到1株具有抑菌活性的乳酸菌菌株LH-09，鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum），CASTROM P等[9]从发酵香肠中分离出一株产细菌素干酪乳杆菌，并研究了影响其细菌素产量的因素。

1.2 产细菌素乳酸菌菌株的植物性发酵食品来源

产细菌素乳酸菌的植物性来源大多为泡菜[10-13]，也有报道从陈醋中可分离产细菌素菌株[14]，发酵蔬菜汁中也可以分离出乳酸菌素，胡美忠等[15]从农家自制酸萝卜、酸白菜、酸辣椒、酸豇豆等发酵蔬菜汁中分离纯化出了两种新型细菌素Plantaricin 163和Plantaricin 163-1；易华西等[16]也曾报道从自制的发酵蔬菜汁-浆水中分离出了产细菌素菌株；闵钟熳等[17]从自制的发酵胡萝卜汁、泡菜汁、黄瓜汁、黄豆汁、绿豆汁中分离筛选出1株乳酸菌，确定为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）；刘书亮等[18]从醪糟中筛选出的P185对多数的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌及一些真菌均具有较强抑制作用。

1.3 其他来源

除来自动植物的产细菌素乳酸菌菌株外，近年来也有报道其他来源的，赵鸭美等[19]从南海海域中捕捞的华贵栉孔扇贝肠道中分离到9株乳酸菌，筛选出1株产细菌素的乳酸菌菌株ZH-54，经鉴定，为坚强肠球菌（Enterococcus durans）；侯运华等[20]从鸡肠道分离筛选出一类具有广谱抑菌活性的类细菌素物质，对溶壁微球菌（Micrococcus Lysodeikticus）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等有强烈抑制作用；张小美等[21]从婴儿粪便中分离得到1株产抑菌活性物质菌株，确定为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）LZ55，能够抑制多种革兰氏阳性菌和阴性菌；王小娜等[22]也从婴儿粪便中分离出一株具有抗菌活性的乳酸菌，命名为Lactobacillus plantarum ZJ317；雷虹等[23]对分离自酸菜的一株产细菌素乳酸菌进行了鉴定，发现该菌株为副干酪乳杆菌，并通过实验证明，该菌株也可以从婴儿粪便、变质的啤酒中分离出来。

2 产细菌素乳酸菌菌株的种属

自1908年METCHNIKOFFE报道了乳酸杆菌能抑制非肠道微生物以来，由乳酸菌产生的抑菌活性物质被广泛研究，至今已经发现至少8个不同属乳酸菌可以产生抑菌活性物质。主要有乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、明串珠菌属（Leuconstoc）、肠球菌属（Enterococcus）、片球菌属（Pediococcus）、链球菌属（Streptococcus）、肉食杆菌属（Carnobacterium）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）等。

2.1 乳杆菌属产细菌素

乳杆菌属是目前报道产细菌素最多的乳酸菌属，已知的乳杆菌属细菌素有plantaricin A、B、C、E、F、K、J、S、T、BN、C19、423、Wα、Wβ、ASM1、NC8β、NC8α、Sα、Sβ、ZJ5；acidocin A、B、J1132β、8912、LF221B；sakacin A、M、G、P；bavaricin MN、A；lactocin F、S、27、705；curvacin A；curvalicin 28a、28b、28c；curvaticin FS47、L442；gassericin A、T；brevicin；helventicin J、V-1829；cascicin 80；fermrnticin；reutericin 6；rhamnosin A；lactacin F、B等。部分乳杆菌属细菌素的来源见表1。

表1 部分乳杆菌属细菌素的来源Table 1 Sources of part of bacteriocins fromLactobacillus

2.2 乳球菌属产细菌素

目前，已知的乳球菌属所产细菌素有lactococcin A、actococcin GJ-9、lactococcin BZ、lactococcin 972、lactococcin R以及由Lactococcus lactisKLDS4.0326和Lactococcus raffinolactisY-12产生的两种未命名的细菌素。

2.3 明串珠菌属产细菌素

ORBERG P K等[34]在1984年报道了3株肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（Leuconostoc mesenteroidessubsp.dextranicum）和2株未知明串珠菌产生的细菌素，这成为明串珠菌产细菌素的较早报道。目前，已报道的明串珠菌细菌素有mesenterocin5、mesenterocin52A、mesenterocin 52B、leucocin C、leuconocin S等。

2.4 肠球菌属产细菌素

屎肠球菌和粪肠球菌是肠球菌中产细菌素报道最多的种。GIRAFFA G等[35]发现奶酪中存在产细菌素肠球菌7C5，经鉴定，为Enterococcusfaecium；CASAUSP等[36]报道屎肠球菌T136可同时产生肠球菌素EnterocinA和EnterocinB；赵鸭美等[19]从华贵栉孔扇贝肠道中分离筛选出1株具有较强抑菌作用的乳酸菌ZH-54，经鉴定，为坚强肠球菌（Enterococcus durans）。

2.5 片球菌属产细菌素

片球菌素是由片球菌属种的乳酸片球菌、啤酒片球菌和戊糖片球菌3种菌产生的。目前，已报道的片球菌素有pediocinAcH、pediocinPA-1、pediocinA、pediocinSJ-1pediocin PD-1及由P.cervesiaeFBB63和P.acidlacticiPC产生的两种未命名的细菌素[37]。

2.6 链球菌属产细菌素

目前已经发现的链球菌属细菌素有Salivaricin A、Salivaricin A2、Salivaricin B、Salivaricin E、Salivaricin G32等羊毛硫抗菌肽细菌素。

2.7 肉食杆菌属产细菌素

肉食杆菌属中已知的细菌素有carnobacteriocinsA1、A2、A3，carnocin U149、carnocin KZ213、carnocin 54、carnocin H、carnobacteriocins B1、B2及由C.piscicolaLK5产生的一种未命名的细菌素。

2.8 双歧杆菌属产细菌素

已发现少数双歧杆菌属菌株也可以产生细菌素，如两歧双歧杆菌NCFB1454[38]、嗜热双歧杆菌RBL67[39]、婴儿双歧杆菌BCRC14602[40]、动物双歧杆菌BB04[41]等。

3 细菌素的分类

由于细菌素的种类很多，故可以依据不同的分类标准进行分类。结果见表2。

表2 细菌素的不同分类方法及结果Table 2 Classification methods and results of bacteriocins

4 细菌素的分离纯化

细菌素是乳酸菌在代谢过程中由其核糖体合成机制产生的具有抑菌活性的多肽，因此，可以根据多肽的理化特性优化细菌素的分离纯化方法。目前，没有一套成型通用的细菌素分离纯化方法，需根据其多肽的性质、产细菌素菌株的来源及特性设计纯化的策略。在大量研究的基础上，可以将细菌素的分离纯化大致归为三个步骤：粗分离、中度纯化和精制。

4.1 粗分离

粗分离的产物纯度在1%左右。目前，常用的方法有沉淀法（盐析法-最常用的是硫酸铵沉淀法、低温有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法）、有机溶剂萃取法（最常用的溶剂是丙酮）、吸附法（pH吸附法、菌体吸附法）、透析法、热变性法和超滤法等。可以根据实验条件和要求的不同，使用一种或几种方法混合使用对上清液进行粗提，如果不了解将要纯化的细菌素性质，建议使用硫酸铵分级沉淀较好，如果对纯度要求较高，可以多种方法结合使用。

4.2 中度纯化

此阶段目的是去除大量杂质，使细菌素纯度达到50%～90%。较成熟的纯化方法有凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水交换层析和亲和层析。离子交换层析是低盐吸附、高盐洗脱，疏水交换层析则是高盐吸附、低盐洗脱，因此，离子交换层析后的高盐样品若直接采用疏水交换层析是最为高效的组合，如PILAR C等[47]在纯化细菌素Enterocin A、B时就选择了在离子交换层析后使用疏水层析的方法，效果较佳。

4.3 精制

此阶段要使细菌素纯度达到99%，大多采用反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）进行纯化，最常用的色谱柱为反相C18柱，流动相多使用乙腈、异丙酮或甲醇，终产品可以用氨基酸自动分析仪分析氨基酸组成，用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪分析分子质量。

在不知道细菌素组成的情况下，一般采用上述三个步骤依次纯化，也有报道仅用两步就能达到纯化目的，SONIAC等[48]通过2次RP-HPLC纯化就得到了纯品；UTENG M等[49]建议两步法提纯Ⅱa类细菌素，主要是利用SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱吸附带正电荷的细菌素，然后再利用反相液相色谱回收。

最近的研究表明，免疫亲和层析法能快速纯化细菌素，如有报道将单克隆抗体antinisinA偶联到HiTrapN-羟基活化柱上，成功实现了一步纯化[50]，目前，一些特殊的抗体（如enterocin B，nizin Z，pediocin PA-1和enterocin P）已经用于细菌素的纯化和检测[51-53]，另外也有采用荧光染色法的，也可以将细菌素直接转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，特异性抗体和免疫组织化学法也被证明是可行的，目前它仅作为一种补充检测和定量细菌素的方法[15]。

5 展望

细菌素的作用机制特殊，致病菌不会对其产生耐药性，也不会像抗生素一样产生耐药株，由于其本质是多肽，在人体内会被蛋白酶消化，因而不会改变人体肠道正常菌群的存活，已经成为现阶段乃至今后很长一段时间微生物天然防腐剂的研究热点。目前，对细菌素的研究依然侧重于开发新的抑菌谱广、抑菌效果好的广谱细菌素，细菌素的分离纯化是研究的重点，确定细菌素的氨基酸序列和组成、编码基因的定位、代谢调控机理以及在食品储存和保鲜中的开发利用将会成为未来细菌素的热点研究方向。

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