HPLC法检测保健品中违禁添加9种化学降糖药物

刘 畅，孔令钰，李 楠，杨 萍

(天津市医药科学研究所，天津 300020)

我国有数量庞大的糖尿病人群，随之而来的降糖产品需求量也很大[1]。除化学合成口服降糖药外，普通糖尿病人对中药和保健品也很信赖。因此，假药生产商在其中非法添加化学合成降糖药物，使其疗效显著以牟取利益[2-6]。格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、吡格列酮、瑞格列奈、格列齐特、格列喹酮、二甲双胍、苯乙双胍因疗效确切、价格低廉被广泛应用其中。而现在对降糖中药和保健品中非法添加药物的检验主要应用液质联用的方法，虽然其专属高效，但因为仪器设备的限制，基层药检部门需要更加适用的方法，本文建立更简单、常规、普及的高效液相色谱法，可供基层食品药品检验机构检验检查，有效打击制假行为。

1 仪器与试药

1.1仪器 岛津LC-20AT高效液相色谱仪；METTLER AE240电子天平。

1.2试药 格列美脲(批号100674-201503)、格列吡嗪(批号100281-201604)、格列本脲(批号100135-201105)、盐酸吡格列酮(批号100634-201202)、瑞格列奈(批号100753-201303)、格列齐特(批号100269-201505)、格列喹酮(批号100280-201403)、盐酸二甲双胍(批号100664-201604)、盐酸苯乙双胍(批号100922-201001)对照品均购于中国食品药品检定研究院；甲醇(DIKMA)为色谱纯；其他试剂均为分析纯；试验用样品胶囊A、胶囊B、胶囊C均于药店及网上购买。

2 方法与结果

2.1色谱条件1(适用于格列类及其他) 色谱柱：TIANHE Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值至3.0±0.05)(70∶30)；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：233 nm；进样量10 μl。以色谱峰的保留时间定性，并以紫外吸收光谱图辅助定性，以外标法峰面积定量。

2.2色谱条件2 (适用于双胍类) 色谱柱：TIANHE Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-离子对试液(辛烷磺酸钠0.585 6 g，加三乙胺1.4 ml，加水至1 000 ml，用磷酸调节pH值至3.5±0．05)(55∶45)；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：233 nm；进样量10 μl。以色谱峰的保留时间定性，并以紫外吸收光谱图辅助定性，以外标法峰面积定量。

2.3溶液的制备

2.3.1对照品溶液的制备 分别精密称取格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、盐酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齐特、格列喹酮适量于同一量瓶中，甲醇定容得到格列类及其他对照品储备液，再取1 ml该储备液，用甲醇稀释至10 ml，得到格列类及其他对照品溶液，浓度分别为20.64、39.88、30.09、59.43、21.73、80.69和69.57 μg/ml。分别精密称取盐酸二甲双胍及盐酸苯乙双胍适量于同一量瓶中，甲醇定容得到双胍类对照品储备液，再取1 ml该储备液，用甲醇稀释至10 ml，得到双胍类对照品溶液，浓度为40.29 及21.52 μg/ml。

2.3.2供试品溶液的制备 取胶囊20粒，去壳，研细，将壳剪碎，内容物粉末和壳分别精密称取0.5 g，置25 ml量瓶中，加适量甲醇，超声处理20 min，冷却至室温，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.4系统适用性试验 取格列类及其他对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，其色谱峰流出顺序依次为盐酸吡格列酮(4.472 min)、格列吡嗪(5.907 min)、格列齐特(7.200 min)、格列本脲(12.367 min)、格列美脲(16.549 min)、瑞格列奈(18.835 min)、格列喹酮(27.598 min)，各降糖药相邻色谱峰分离度均大于1.5且峰对称性较好，见图1。取双胍类对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件分析，其色谱峰流出顺序依次为盐酸二甲双胍(3.828 min)、盐酸苯乙双胍(6.252 min)，两种降糖药色谱峰分离度大于1.5且峰对称性较好，见图2。

1.盐酸吡格列酮 2.格列吡嗪 3.格列齐特

1.盐酸二甲双胍 2.盐酸苯乙双胍

2.5标准曲线和线性范围 在选定的色谱条件下，取两种对照品储备液加甲醇稀释成6个水平的系列对照品工作溶液进行分析。以峰面积和质量浓度作标准曲线，得到线性回归方程，相关系数在0.999 4～0.999 9之间，表明各化合物在相应的浓度范围内呈良好的线性关系。见表1。

2.6检出限和定量限试验 以对照品溶液逐步稀释至峰高为信噪比3倍时，格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、盐酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齐特、格列喹酮、盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍检出限分别为0.72、0.40、0.75、0.59、0.65、0.48、0.83、0.32和0.86 μg/ml；至峰高为信噪比10倍时，格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、盐酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齐特、格列喹酮、盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍定量限分别为2.0、1.2、2.0、1.7、1.7、1.6、2.4、1.2和2.6 μg/ml。

2.7精密度试验 取对照品溶液，重复进样5次，记录色谱图，测得峰面积。结果格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、盐酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齐特、格列喹酮、盐酸二甲双胍和盐酸苯乙双胍峰面积的RSD分别为1.20%、0.67%、1.39%、1.03%、1.00%、1.70%、1.61%、0.44%和1.87%，表明精密度较好。

表1 各降糖药的标准曲线、相关系数和线性范围

2.8重复性试验 取确定不含上述化学合成降糖药的保健品(胶囊A)，加入稀释后的对照品储备液，按照“2.3.2”项下方法对其进行处理，并按“2.1”和“2.2”项下色谱条件测定峰面积，重复5次，格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、盐酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齐特、格列喹酮、盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍含量的RSD分别为2.30%、0.31%、1.63%、2.14%、1.88%、2.21%、2.07%、1.16%和2.67%，表明方法的重复性较好。

2.9稳定性试验 取“2.8”项下制备的样品，在放置不同时间段(0、2、4、8、12和24 h)进样测定，结果格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、盐酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齐特、格列喹酮、盐酸二甲双胍和盐酸苯乙双胍峰面积的RSD分别为1.86%、1.02%、0.97%、1.66%、0.76%、1.77%、1.78%、0.69%和0.83%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。

2.10回收率试验 分别精密吸取两种对照品储备液1、2和3 ml各3份置25 ml量瓶中，再精密加入确定不含上述化学合成降糖药的中药保健品(胶囊A粉末)0.5 g，加适量甲醇，超声处理20 min，冷却至室温，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，测定试验回收率。结果格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、盐酸吡格列酮、瑞格列奈、格列齐特、格列喹酮、盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍平均回收率分别为100.8%、102.0%、99.7%、101.7%、104.3%、101.2%、98.8%、100.0%和99.5%；RSD分别为1.44%、1.17%、1.95%、1.18%、1.82%、1.05%、1.84%、1.06%和1.96%。见表2-10。

表2 格列美脲回收率试验结果

表3 格列吡嗪回收率试验结果

表4 格列本脲回收率试验结果

表5 盐酸吡格列酮回收率试验结果

表6 瑞格列奈回收率试验结果

表7 格列齐特回收率试验结果

表8 格列喹酮回收率试验结果

表9 盐酸二甲双胍回收率试验结果

表10 盐酸苯乙双胍回收率试验结果

2.11样品测定 运用本文建立的方法对胶囊A、胶囊B、胶囊C三种保健品进行测定，结果表明胶囊C粉末中含有一个保留时间为12.472的峰，与保留时间为12.367的格列本脲对照品一致，其紫外吸收也一致，初步确定该样品中含有格列本脲，含量为1.28 mg/g，其他胶囊粉末和胶囊壳中均未检出上述化学降糖药物。色谱图见图3-图4。

1.格列本脲

图4 格列本脲(A)及胶囊C粉末(B)的紫外光谱图

3 讨论

3.1双胍类药物具有较强极性，使用常规流动相冲洗，柱保留时间短，加入辛烷磺酸钠作为离子对试剂，柱有很好的保留，而这种条件下格列类的化合物难以分离，因此建立了两种HPLC条件。

3.2为了简化试验步骤并保证较高的提取效率，本文采用超声的方式来对样品进行提取。化学降糖药物在甲醇中均有良好的溶解性，故选择甲醇作为溶剂。

3.3使用化学合成药物过量时会有不同程度的不良反应，抗糖尿病药物的不良反应主要有代谢和营养障碍，神经系统损害和胃肠系统的损害，磺酰脲类降糖药的不良反应体现为胃肠道反应、低血糖、过敏反应、血液系统反应、肝损伤、肾损伤等[7，8]。本试验中，初步判断一种保健品中含有化学合成药。在保健品中添加化学合成药物，普通消费者会在平时长期服用该保健品过程中用药过量，出现不良反应而不自知，或在服用过程中与某些药物联用，可能出现药物的相互作用，对身体造成较大伤害。

1 黄海燕,饶伟文,钟建理.降糖类中成药和保健食品中非法添加化学药品的研究概况[J].中国药业,2014,23(5):94-96

2 徐文峰,金鹏飞.降糖类中成药和保健食品中非法添加化学药物检测技术的研究进展[J].中南药学,2016,14(11):1233-1237

3 陈洪忠,巩建华.创新药品监督抽验理念打击中药制剂中非法添加化学物质的违法行为[J].齐鲁药事,2009,28(6)：324-326

4 励炯,曹青文,王姣斐,等.基于实心核颗粒色谱技术结合HPLC法快速测定保健食品中非法添加13种降糖化学成分[J].中草药,2017,48(13):2666-2673

5 王巍,毛庆.中成药和保健食品中非法添加化学物质的研究进展[J].广东化工,2016,43(22):120-121

6 董永成,杜士明,陈永顺,等.中成药及保健食品非法添加化学成分的类型、危害以及对策[J].时珍国医国药,2006,7(8):1601-1602

7 王兰兰.抗糖尿病药物所致临床不良反应的临床分析[J].糖尿病新世界,2015,18(2):5-6

8 王军生.磺酰脲类降糖药不良反应研究分析[J].中国卫生标准管理,2015,6(21):89-90