HPLC法同时测定头痛滴丸中的阿魏酸和木犀草苷的含量

杨金颖

(天津市武清区中医医院，天津 301700)

头痛滴丸是由川芎、藁本、菊花等8味中药组成的复方制剂，具有疏风止痛、凉肝熄风之功，临床用于治疗血管性头痛。阿魏酸是川芎、藁本的共有成分，木犀草苷是菊花的有效成分，二者均有一定的抗炎和镇痛作用[1，2]，均为头痛滴丸的主要活性成分。中药制剂涉及多个成分，单一指标成分不足以代表处方的整体作用，本试验采用HPLC法同时测定阿魏酸和木犀草苷两指标成分，为建立头痛滴丸的质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 高效液相色谱仪：安捷伦液相色谱仪1100系列(包括安捷伦色谱工作站、G1310A四元液相梯度泵、G1313A自动进样器、G1314AVWD检测器、CO-201柱温箱)；分析柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；BD211D型电子天平 (十万分之一，Sarlorius提供)；AB204-N型电子分析天平(万分之一，Mettler-Toledo提供)。

1.2试药 阿魏酸对照品(批号110773-201313，含量以99.6%计)、木犀草苷对照品(批号111720-201408，含量以94.9%计)均购自中国食品药品检定研究院。头痛滴丸为自制样品(批号100001，100002，100003)。乙腈、磷酸为色谱纯；水为娃哈哈纯净水。

2 含量测定方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱程序：0～15 min A-B(18∶82)，15～30 min A-B(18∶82→20∶80)，30～35 min A-B(20∶80→30∶70)；流速：1.0 ml/min；检测波长：328 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μl。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备 分别称取阿魏酸和木犀草苷对照品适量，精密称定，各置于50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别得储备液；各取适量储备液置50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得1 ml含阿魏酸19.74 μg和木犀草苷26.38 μg的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 取研细的本品约0.15 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入15 ml流动相，密塞，称定重量，然后超声处理30 min，放至室温，用流动相补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液。

2.2.3阴性对照溶液的制备 按处方比例分别称取本处方中缺菊花药材的阴性对照和缺川芎及藁本药材的阴性对照，经提取、萃取后，按照滴丸成型工艺用相应辅料制备阴性供试品，按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3专属性试验 分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl，依“2.1”项下色谱条件进样测定。结果在该方法下样品分离度好，阴性对照对测定无干扰。色谱图见图1。

2.4线性关系的考查 分别称取阿魏酸和木犀草苷对照品适量，精密称定，各置于50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别得储备液；再配成系列浓度混合对照品溶液(分别含阿魏酸2.01、4.02、12.05、20.08、32.13和40.16 μg/ml，含木犀草苷2.20、4.40、13.19、21.98、44.96和65.94 μg/ml)。依“2.1”项下色谱条件进样检测分析，分别以阿魏酸和木犀草苷的峰面积值为纵坐标(Y)，对照品浓度(μg/ml)为横坐标(X)绘制标准曲线，得阿魏酸回归方程为Y=52.069X-0.111 7(r=0.999 9)，线性范围为2.01～40.16 μg/ml；木犀草苷回归方程为Y=12.279X+17.947(r=0.999 8)，线性范围为2.20～65.94 μg/ml。

1.木犀草苷 2.阿魏酸

2.5精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μl，连续进样6次，记录峰面积，分别计算阿魏酸和木犀草苷峰面积的RSD值，结果分别为0.63%和0.57%，表明仪器精密度良好。

2.6稳定性试验 取同一供试品溶液(批号100001)，室温放置，分别于0、2、4、8、12和24 h，依“2.1”项下色谱条件测定，结果阿魏酸和木犀草苷峰面积的RSD分别为0.89%和1.17%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.7重复性试验 取同一批号供试品(批号100001)6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，结果阿魏酸RSD为0.79%，木犀草苷RSD为1.22%，表明该方法的重现性良好。

2.8回收率试验 精密称取已知含量的供试品(批号100001)9份，每份约0.075 g，精密称定，分别置于9个具塞三角瓶中，各取3份分别精密加入混合对照品(含阿魏酸浓度为0.032 8 mg/ml，木犀草苷浓度为0.031 6 mg/ml)4、5和6 ml，最终加溶剂为15 ml，超声提取30 min，放至室温，用流动相补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液10 μl，依“2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率，阿魏酸和木犀草苷的平均回收率分别为100.33%和100.06%，RSD%分别为1.12%和1.27%。结果见表1和表2。

表1 阿魏酸加样回收率试验测定结果(n=9)

表2 木犀草苷加样回收率试验测定结果(n=9)

2.9样品的测定 取3批头痛滴丸样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积并计算3批样品中阿魏酸和木犀草苷的含量，结果见表3。

表3 头痛滴丸的含量测定结果

3 讨论

3.1提取方法的考查 在供试品溶液制备方法中，提取溶媒研究中曾使用甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇和流动相进行提取，比较后发现用流动相超声提取的样品得到的阿魏酸和木犀草苷的含量高，因此采用流动相提取。研究中还对提取时间进行了考查，分别超声提取20、30、45和60 min，结果表明提取30 min时木犀草苷已提取完全，且杂质较少。

3.2流动相的选择 本试验分别考查甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、甲醇-水溶液和乙腈-水溶液对色谱峰的分离能力，也考查等度洗脱和梯度洗脱，结果表明采用乙腈-磷酸水溶液进行梯度洗脱，可以将阿魏酸和木犀草苷实现较好的分离。对于检测波长的选择，综合考虑《中国药典》[3]、DAD检测器、紫外全波长扫描的结果，最终选择328 nm为最佳检测波长。

本试验采用高效液相色谱法同时对阿魏酸和木犀草苷进行含量测定，并进行了方法学研究及3批样品的含量测定，结果表明该法简便准确、重现性好、专属性较强，可有效地控制头痛滴丸的质量，为完善其质量标准提供了参考依据，对中药复方新药研究及质量控制提供参考。

1 邹全飞,马坤,陆榕.阿魏酸药动学研究进展[J].药物评价研究,2013,36(4):297-301

2 刘圆,李园园,冯婷婷,等.木犀草素镇痛抗炎作用的实验研究[J].齐齐哈尔医学院学报,2010,31(15):2368-2370

3 中国药典[S].一部.2015：41,311,38