茜草炭复合提取物对子宫内膜异位症模型大鼠在位内膜增殖、凋亡及内膜组织VEGF、NF-κB的影响

贾晓慧，侴 琳，周晓丽

0 引言

子宫内膜异位症(Endometriosis，EMT)是指有活性的内膜细胞种植在宫腔以外的位置而形成的一种育龄期妇女常见的雌激素依赖性疾病[1]。其主要病理变化为异位内膜周期性出血及其周围组织纤维化，形成异位结节，导致痛经、慢性盆腔痛、月经异常和不孕等症，因其病因不明确、易复发、难以根治等现状，严重威胁女性健康和生活质量。目前临床治疗手段主要为频繁手术治疗或长期药物治疗，但如何克服手术易复发、药物长期服用不良反应大等缺点，成为现今治疗子宫内膜异位症研究的热点和难点。中医研究认为，子宫内膜异位症的基本病机是血瘀，即“血瘀日久，蕴久化毒、瘀毒伤络”，进而导致机体微循环及血液动力学的改变，中医药治疗针对其病机本质进行活血化瘀论治[2-3]。研究表明，异位内膜的病变可影响在位内膜细胞的增殖、凋亡及内膜组织中相关因子(如VEGF、NF-κB)的表达异常,从而促进EMT的发生和发展，即在位内膜与异位内膜二者病灶之间相互影响，表明改善在位或异位的病理状态均有助于控制EMT的发展[4-5]。本文通过研究单味中药茜草炭的复合提取物对子宫内膜异位症模型大鼠在位内膜增殖、凋亡及内膜组织中VEGF、NF-κB表达的影响，阐述其治疗子宫内膜异位症的作用机制，为其推广提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 选用性成熟的SPF级健康未交配雌性SD大鼠80只，体重(200±20)g，购自浙江省实验动物中心，动物合格证号：SCXK(浙)2014-0001；饲养环境：室温18～22 ℃，相对湿度40%～50%，标准饲料和水饲养。

1.1.2 实验仪器与试剂 二步法免疫组化检测系统，PV-900，北京中杉金桥生物技术有限公司；显微镜，上海谱骞光学仪器有限公司。90%乙醇，分析纯，广州市光华化学试剂厂；PCNA单克隆抗体，通用型二步法免疫组化检测试剂盒，TUNEL试剂盒购于南京建成生物工程研究所；VEGF多抗试剂盒，NF-κB一抗均购于武汉博士德生物技术有限公司；DAB试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司。

1.1.3 实验药品 茜草购自北京同仁堂连锁药店有限公司，经南京中医药大学吴启南教授鉴定为茜草科植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根和根茎，茜草炭按照2015年版《中华人民共和国药典》炒炭法(通则0213)相关规定炒制表面焦黑色；孕三烯酮，批准文号：国药准字H19980020，规格：25 mg/粒，华润紫竹药业有限公司；注射用青霉素钠，批准文号：国药准字H13020657，规格：2.4 g(400万U)，华北制药股份有限公司；戊巴比妥钠，批准文号：国药准字H31021724，规格：0.25 g/瓶，上海新亚药业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 供试品溶液的制备 取茜草炭800 g，加入8倍量90%乙醇加热回流提取2次，每次90 min，残渣加8倍量水加热回流提取2次，每次90 min，合并4次滤液，减压回收溶剂至干，干膏得率为20.08%。分别按照给药剂量取适量干膏，以0.9%生理盐水稀释至相应浓度。

1.2.2 动物模型的建造 SD大鼠适应性喂养7 d，每天同一时间进行阴道涂片(以0.9%生理盐水冲洗阴道后，吸取少量阴道分泌物涂片镜检，镜下见有大量表层脱落细胞者为动情期)，监测并统计大鼠动情规律，待规律稳定后于第3个动情期进行EMT模型建立。以自体子宫内膜移植法[6]建立模型：取大鼠，以1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，将大鼠取仰卧位，四肢及头部均固定于手术板上，下腹部剪毛备皮，碘伏消毒。于无菌条件下，沿腹中线尿道口上方1 cm处纵行剪开约3 cm的皮肤切口，逐层剪开腹壁肌肉及腹膜，进入腹腔，分离并暴露左侧子宫角，以行端对端吻合术切下左侧子宫角中段长约2 cm，置于盛有生理盐水的无菌培养皿中。取与肌层分离的子宫内膜，剪成0.5 cm×0.5 cm大小的内膜块。取内膜块，以可吸收缝线四角缝固于右侧腹壁血管交叉处，内膜面贴腹壁。以生理盐水冲洗腹腔，逐层缝合腹部切口。术后肌注青霉素0.4万U/只，连续5 d，预防感染。术后大鼠分笼单放，使其自然苏醒，常规饲养。于术后4周再次开腹，观察移植物生理形态。造模成功标准：出现移植灶体积增大，呈现内有澄清液体积聚的囊状，移植物被结缔组织覆盖，并有血管形成，质地软。假手术组仅进行开腹操作，不进行子宫内膜移植。

1.2.3 动物分组及给药 将建模成功的大鼠饲养1个月后，取60只随机分为6组，分别为模型组、QCS低剂量组[900 mg/(kg·d)]、QCS中剂量组[1 800 mg/(kg·d)]、QCS高剂量组[3 600 mg/(kg·d)]、孕三烯酮组(每周给药0.45 mg/kg，每周一、周四以0.9%生理盐水溶解灌胃，其余时间以生理盐水灌胃)及假手术组，模型组与假手术组每日分别以等量的0.9%生理盐水灌胃[按照人体(70 kg)等效剂量换算：大鼠给药剂量=6.3×人临床剂量mg/kg，以此为低剂量组给药量，茜草炭复合提取物给药剂量均以茜草炭生药量计，分别取对应量的复合提取物，以0.9%生理盐水4 ml溶解灌胃]。连续给药4周。

1.2.4 观察异位病灶 末次灌胃后24 h，大鼠全部颈椎脱臼法处死，以游标卡尺测量给药前后各组异位病灶的体积(V=0.52×长×宽×高，mm3)。于无菌条件下切取大鼠在位内膜组织，以10%甲醛液固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色后于光学显微镜下观察组织病理学变化。

1.2.5 在位内膜细胞增殖状态的检测 采用免疫组化法[7]检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，每张切片随机选取5个高倍视野(400×)进行图片采集，采用Image Pro Plus 6.0软件分析细胞增殖指数。增殖指数(%)=增殖细胞/(增殖细胞+正常细胞)×100%。

1.2.6 在位内膜细胞凋亡状态的检测 采用TUNEL技术[8]，实验步骤均严格按照试剂盒说明书进行，每张切片随机选取5个高倍视野(400×)进行图片采集，采用Image Pro Plus 6.0软件分析凋亡指数，凋亡指数(%)=凋亡细胞/(凋亡细胞+正常细胞)×100%。

1.2.7 VEGF、NF-κB表达的检测 以免疫组织化学法检测VEGF、NF-κB蛋白的表达，以逆转录PCR(RT-PCR)法检测VEGF mRNA及NF-κB mRNA的表达。实验步骤均严格按照试剂盒说明书进行，应用Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件测定积分光密度(IOD)值，IOD值越大，表明蛋白及mRNA表达越强。每张切片随机选取5个视野，取IOD均值。

2 结果

2.1 异位病灶的结果观察 EMT主要病理性增殖症状的外在表现为异位内膜病灶体积的变化，观察病灶部位呈圆形或扁圆形的囊状，囊内充满白色或淡黄色透明积液，其表面有血管生长。经孕三烯酮及QCS治疗后，病灶体积对比治疗前均有减小，且孕三烯酮组及QCS的中、高剂量组与治疗前比较差异均有统计学意义(P<0.05)，QCS低剂量组治疗前后比较差异无统计学意义(P>0.05)。QCS高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，与孕三烯酮组比较差异有统计学意义(P<0.05)。模型组治疗前后比较，病灶体积不但无缩小，反而继续生长，且差异有统计学意义(P<0.05)，说明病变仍在发展。见表1。

表1 各组试验前后异位病灶体积比较(mm3)

注：与试验前比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与孕三烯酮组比较，△P<0.05

2.2 各组大鼠在位内膜细胞增殖指数比较 经PCNA法检测六组大鼠的在位内膜细胞增殖情况可知，模型组与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)；孕三烯酮组及QCS中、高剂量组与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；QCS低剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。QCS高剂量组与孕三烯酮组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结果见图1。

2.3 各组大鼠在位内膜细胞凋亡指数比较 TUNEL阳性表现：凋亡细胞的细胞核为棕色或棕黄色，呈碎点状分布，大小不一致。而正常细胞的细胞核经HE染色为紫色，形态大小相对一致。每张切片均选取5个高倍镜视野并进行数据分析。模型组与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)；孕三烯酮组及QCS中、高剂量组与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；QCS低剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。QCS高剂量组与孕三烯酮组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结果见图2。

图1 各组在位内膜细胞增殖情况比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与孕三烯酮组比较，△P<0.05；1.假手术组，2.模型组，3.孕三烯酮组，4.QCS低剂量组，5.QCS中剂量组，6.QCS高剂量组(下同)

图2 各组在位内膜细胞凋亡情况比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与孕三烯酮组比较，△P<0.05

2.4 茜草炭复合提取物对子宫内膜异位症模型大鼠内膜组织VEGF及NF-κB的影响

2.4.1 VEGF蛋白及mRNA在EMT模型大鼠内膜组织中的表达 应用免疫组织化学法及RT-PCR法检测各组VEGF蛋白及mRNA的表达，结果以IOD均值表示。模型组与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)；孕三烯酮组及QCS中、高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；QCS低剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。QCS高剂量组与孕三烯酮组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.4.2 NF-κB蛋白及mRNA在EMT模型大鼠内膜组织中的表达 应用免疫组织化学法及RT-PCR法检测各组NF-κB蛋白及mRNA的表达，结果以IOD均值表示。模型组与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)；孕三烯酮组及QCS中、高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；QCS低剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。QCS高剂量组与孕三烯酮组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 各组VEGF蛋白及mRNA的表达情况比较

注：与模型组比较，#P<0.05；与孕三烯酮组比较，△P<0.05

表3 各组NF-κB蛋白及mRNA的表达情况比较

注：与模型组比较，#P<0.05；与孕三烯酮组比较，△P<0.05

3 讨论

EMT是指具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫体腔以外的部位，为育龄期女性常见病、多发病[9]。虽然EMT是公认的良性疾病，但因其具有转移、种植、生长等恶性肿瘤相关的生物学特性，仍具有一定的恶变率，亦是妇产科的棘手疾病之一。因其具有多因素、多环节致病的复杂性发病机制，给研究者带来较多困难，目前针对EMT的具体发病机制仍不明确。

因EMT具体致病机制的多样性及不确定性，针对本病的治疗方法亦多种多样[10-12]。临床上主要采用西药、手术及中医药治疗。因其为激素依赖性疾病，故西药主要为激素类药物，此类药物价格昂贵且不良反应较大，给患者带来经济及生活双重压力，患者依从性较差，临床适用性差，难以普遍推广；大多数患者首选手术治疗，手术治疗伴随着复发率高，即接二连三的手术亦给患者带来较大困扰。针对此种情况，中医药疗法逐渐突出其治疗疾病多靶点、多途径的优势，既能改善患者的临床症状，减轻疾病带给患者的痛苦，又能克服西药不良反应大及手术复发率高的缺点。探索出比较适用的中医药疗法，为治疗本病提供一个新的思路和方向。目前寻找中药复方从细胞增殖、凋亡及内膜组织血管中的多种因子进行EMT病因病机的探讨成为目前治疗EMT的研究热点。

研究表明，VEGF为促进血管生成的重要因子之一，新血管的形成可促进内膜的生长、转移及扩散,而内膜的生长又可上调VEGF的表达，最终导致病灶的蔓延[13-15]。NF-κB为细胞非特异性的转录因子，可调节多种细胞、生长因子及部分活性蛋白基因的转录，广泛参与机体的免疫、炎症等生理病理过程，研究表明，NF-κB因子的异常活化，可引起局部的炎症反应，促进病灶扩大[16-17]。

本研究以中医针对EMT的“血瘀”病机理论为指导，以自体移植法建立子宫内膜异位症大鼠模型，采用临床抗血瘀效果显著[18-19]的茜草炭复合提取物(QCS)探究作用机理。结果表明，治疗后，孕三烯酮组及QCS中、高剂量组病灶体积均小于模型组，且QCS高剂量组病灶体积小于孕三烯酮组；孕三烯酮及QCS中、高剂量均能显著促进在位内膜细胞凋亡，抑制增殖，且QCS高剂量效果优于孕三烯酮；孕三烯酮及QCS中、高剂量均能显著下调在位内膜VEGF、NF-κB蛋白及mRNA的表达，且QCS高剂量下调效果优于孕三烯酮。

综上所述，茜草炭复合提取物治疗子宫内膜异位症的主要机制为促进在位内膜细胞凋亡，抑制在位内膜细胞增殖，且能显著下调在位内膜VEGF、NF-κB蛋白及mRNA的表达，QCS中、高剂量疗效良好，不良反应较少。

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