HPLC-ELSD法测定肠腑康胶囊A中黄芪甲苷的含量

2018-07-06杨智峰谢志民

实用药物与临床 2018年6期

张鑫，杨智峰，谢志民*

0 引言

肠腑康胶囊A是陕西省科技统筹创新工程计划项目资助开发的纯中药制剂，由黄芪、党参、炒白术、炒山楂、茯苓、干姜、木香、炒薏苡仁、制薏苡仁、陈皮、甘草等提取精致组成，具有健脾益气、止泻解毒的功效，主要用于治疗由于脾虚气滞导致的溃疡性结肠炎等[1]。本课题组曾报道了肠腑康胶囊的提取工艺研究[2-3]和质量标准中山楂、薏苡仁和甘草的薄层鉴别等[4-5]，尚未建立含量控制项目。鉴于黄芪为方中君药，主要活性成分为多糖类和黄芪甲苷类，其中黄芪甲苷[6-7]具有抗病毒、保护心肺、增强机体免疫能力的作用，与其在本制剂中的药理作用一致。本实验参考相关文献[8-9]和《中国药典》[10]，建立HPLC-ELSD法测定肠腑康胶囊A中黄芪甲苷含量的质量控制方法。

1 仪器与试药

LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本Shimadzu仪器公司)；PL-ELS2100蒸发光检测器(英国Polymer Laboratories公司)，BT124S、BT25S型电子天平(德国赛多利斯)，KQ-700VDB型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；肠腑康胶囊A(陕西省中医医院制剂，规格：0.38 g，批号：20170310、20161116、20161230)；黄芪甲苷对照品(批号：110781-201314，含量95.8%)购于中国食品药品检定研究院，供含量测定使用；氮气为高纯氮气(纯度≥99.999%)，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Welch UltimateXB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：乙腈-水(38∶62)；流速1.0 ml/min；柱温30 ℃，漂移管温度83 ℃，雾化温度55 ℃，氮气作为载气，流速2.5 ml/min。进样量：对照品溶液5、15 μl，供试品溶液15 μl。色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品5.16 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，即得(每1 ml含0.516 mg)。

2.2.2 供试品溶液的制备取肠腑康胶囊A样品(批号：20170310)50粒内容物，研匀，取约7.8 g(含黄芪约3 g)，精密称定，置具塞三角瓶中，加甲醇40 ml，超声处理(功率240 W，频率45 kHz)30 min，滤过，药渣再加甲醇超声洗涤3次，每次10 ml/5 min，合并滤液，回收溶剂并浓缩至干；残渣加水20 ml，微热使溶解；用水饱和的正丁醇振摇提取5次(20、20、20、15、15 ml)，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的1%氢氧化钠溶液充分洗涤2次，每次40 ml，碱液合并，用水饱和的正丁醇20 ml振摇提取，合并正丁醇液；用水洗涤2次，每次20 ml，水液合并，用水饱和的正丁醇20 ml振摇提取，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 标准曲线的考察精密吸取上述对照品溶液3、6、9、12、15、17 μl，各进样2次，按“2.1”项下的色谱条件进行测定。结果以峰面积平均值的对数为纵坐标，以进样量质量(μg)的对数为横坐标，计算得回归方程Y=1.553 2 X+4.723 5，r=0.999 6，表明黄芪甲苷进样量在1.48～8.40 μg时，峰面积对数与进样量对数呈良好线性关系。

2.4 精密度实验精密吸取对照品溶液3、10、17 μl，各进样6次，按“2.1”项下的色谱条件测定峰面积，结果RSD分别为0.22%、0.34%、0.16%，表明进样精密度良好。

2.5 重复性实验取批号20170310的样品，按照“2.2.2”项下的方法制备6份供试品溶液，然后按“2.1”项下的色谱条件测定峰面积并按照两点对数法计算含量，结果平均含量为0.234 2 mg/g，RSD为3.21%。

2.6 稳定性实验取“2.2.2”项下供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件分别在0、1、2、4、8、16、24 h测定峰面积，结果RSD为1.88%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 干扰实验按照处方工艺和处方量，制备缺黄芪药材的阴性样品，精密称取粉末7.8 g，置具塞锥形瓶中，按照“2.2.2”项下的方法制成阴性对照液。按“2.1”项下的色谱条件测定色谱图，并与供试品和对照品色谱图比较，结果缺黄芪的阴性样品色谱中，在与黄芪甲苷对照品色谱相应的位置上未见色谱峰，表明处方中其他药味对黄芪甲苷的含量测定无干扰。

2.8 加样回收率实验精密称取黄芪甲苷对照品11.56 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇使溶解，并加至刻度，摇匀，作为对照品溶液(0.46 mg/ml)。取本品20170310批次内容物约38 g，研匀，精密称取3.9 g，共9份，置具塞锥形瓶中，3份为1组，分别精密加入上述黄芪甲苷对照品溶液1、2、3 ml，加入甲醇40 ml，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，按照“2.1”色谱条件进行测定。见表1。

2.9 样品含量测定取3批肠腑康胶囊A样品，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，按照“2.1”项下色谱条件进行测定。见表2。

3 讨论

3.1 供试品制备方法选择本次实验首先比较了样品甲醇超声提取液蒸干、水溶后，分别用正丁醇提取及碱洗、直接过大孔吸附树脂柱以及用正丁醇提取、碱洗、过大孔吸附树脂柱提取的净化效果。结果显示，以正丁醇提取、碱洗、过大孔吸附树脂柱净化效果最好，但峰面积稍小；正丁醇提取、碱洗提取效果最好，峰面积最大，而脂溶性杂质较多，但在上述色谱条件下不影响黄芪甲苷的测定。故确定采用正丁醇提取、碱洗的方法制备供试品溶液。接着采用L9(33)正交实验对正丁醇提取次数(3、4、5次)、碱洗次数(2、3、4次)和水洗涤次数(2、3、4次)进行了考察，结果表明，正丁醇提取次数对测定结果有显著性影响，碱洗次数有影响但不显著，水洗涤次数无影响，因此，确定正丁醇提取次数5次、碱洗和水洗2次为最佳提取工艺。

表1 加样回收实验结果(n=9)

表2 三批样品中黄芪甲苷含量测定结果

3.2 检测器条件的选择本实验对蒸发光检测器的气化温度、雾化温度进行了优化，结果显示，当气化温度升高至90 ℃以上时，峰形特别尖锐，出现直角峰，基线噪音全无，峰面积较小；当气化温度降为83 ℃、雾化为55 ℃时，峰形较好，噪音峰出现，峰面积最大，分离度>1.5，峰形对称。因此确定蒸发光检测器的气化温度为83 ℃、雾化温度为55 ℃。

3.3 系统适用性的考察采用同一供试品溶液在不同流速(0.8～1.2 ml/min)、不同乙腈-水的流动相比例(34∶66～42∶58)和不同色谱柱(Welch Materials Inc，Agilent5TC-C18，Welch ultimate XBC-C18，Boston Green SOD，资生堂Capcell Pak C18)条件下测定色谱图，比较色谱峰分离度、理论塔板数、不对称度和拖尾因子，结果表明，流速在0.8～1.2 ml/min范围内、流动相比例在34∶66～42∶58范围内黄芪甲苷分离完全、峰形对称，理论塔板数最低为4 953，不同厂家色谱柱均能够使黄芪甲苷分离良好、峰形对称，理论塔板数最低为3 604，因此，建立的方法可以用于肠腑康胶囊中黄芪甲苷的含量测定。