恩度联合紫杉醇对C57BL/6肺癌小鼠肿瘤生长及CA Ⅸ、HIF-1α表达的影响

赵 娜，罗孟亚男

0 引言

肺癌是恶性肿瘤中发病率和死亡率最高的癌症之一[1]，全世界每年新增的肺癌病例大约120万，严重威胁着人类的身体健康和生命安全。目前临床上常用的治疗肺癌的方法有化学治疗、放射治疗和外科手术治疗，化疗和放疗在杀死癌细胞的同时，也会杀死对机体有益的细胞，不良反应较多，包括放射性食管炎和放射性肺炎[2]；手术治疗主要适用于肺癌早期患者，而且肺癌根治术后2年内复发率在80%左右，远处转移的发生率高于局部复发率[3]。因此，采用安全有效的药物治疗肺癌成为研究的热点问题，植物来源的药物已经普遍应用于癌症治疗中，而紫杉醇是目前最有前景的植物抗癌药物，与其他抗癌药物相比具有抗癌范围广、药物效应强的特点。本试验旨在研究紫杉醇在肺癌治疗中的优势和疗效。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 具有高自发肺转移潜能的Lewis肺癌瘤株，移植100%，来源:国家实验细胞资源共享平台(China Infrastructure of Cell Line Resource)。

1.1.2 实验动物 C57BL/6近交系小鼠，7～8周龄，体重23～25 g，雌雄各半，购自第一军医大学动物中心(合格证号:P7A03)。

1.1.3 主要试剂与仪器 恩度(15 mg/支，国药准字S20050088，山东先声麦得津生物制药有限公司)；紫杉醇(30 mg/支，国药准字H20053837，安徽大东方药业有限责任公司)；DAB显色试剂盒均购自北京中杉公司；免疫组化试剂盒购于福州迈新公司；小鼠缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和碳酸酐酶Ⅸ(CA Ⅸ)ELISA试剂盒购自英国Abcam科技有限公司；电子天平购自美国Thermo Fisher Scientific公司；光学显微镜和显微摄像仪购自日本Olympus公司；3K15超低温离心机购自德国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6小鼠肺癌造模 将购买的小鼠Lewis肺癌细胞解冻、复苏，取0.2 ml贴壁生长的对数期(细胞数为1×107/ml)的Lewis肺癌细胞接种于C57BL/6小鼠右腋下，接种后第21天，选取精神和食欲良好的小鼠进行脱颈椎处死，取出生长良好的无破溃的肿瘤组织进行体内传代：取完整的瘤组织，去除包膜后，选取鱼肉状组织制成单细胞悬液，调整细胞数目为1×107/ml，将癌细胞悬液分别接种于5组小鼠右腋下，0.2 ml/只。

1.2.2 实验分组 将300只C57BL/6肺癌小鼠按照随机数字表法平均分成5组，每组60只，雌雄各半，分别命名为空白对照组、正常对照组、紫杉醇低剂量组、紫杉醇中剂量组和紫杉醇高剂量组，正常对照组注射7.5 mg/m2恩度进行治疗，空白对照组注射等量容积生理盐水，紫杉醇低剂量组、紫杉醇中剂量组和紫杉醇高剂量组在正常对照组的基础上分别注射30、100、170 mg/m2紫杉醇进行治疗。治疗时间为4周。

1.2.3 观察指标 ①肺癌细胞移植前记录5组小鼠的体重；②测量治疗过程中小鼠肿瘤的生长情况：给药第4、10、16、22、28天用游标卡尺测量肿瘤的最大径(a)及最小径(b)，计算肿瘤的体积(V)，V=ab2/2，绘制肿瘤生长曲线；③记录5组小鼠的瘤重及抑瘤率：持续治疗4周后将小鼠脱颈椎处死，将肿瘤组织剥离出来，记录肿瘤组织的重量及抑瘤率，抑瘤率(%)=[对照组平均瘤重(g)-实验组平均瘤重(g)]/对照组平均瘤重(g)×100%。

1.2.4 免疫组化检测CA Ⅸ、HIF-1α的表达水平及结果判定 持续治疗4周后，选取生长良好的肿瘤组织制作石蜡切片(厚度不超过5 mm)，将组织切片在92～98 ℃条件下存放20 min进行抗原修复，滴加正常山羊血清用来中和非特异性反应后，在组织玻片上分别滴加CA Ⅸ和HIF-1α一抗，于4 ℃过夜放置，复温后在组织玻片上滴加二抗。使用DAB显色试剂进行底物显色，当呈现金黄色时终止显色反应，使用苏木素进行复染后，用奥林帕斯CCD摄像机随机采集5个视野(400×)的图片，观察CA Ⅸ和HIF-1α蛋白在癌细胞胞核和(或)胞质的表达情况。

1.2.5 ELISA检测CA Ⅸ、HIF-1α的表达水平 持续治疗4周后，各组分别取5只小鼠眼眶静脉血，采用CA Ⅸ、HIF-1α ELISA试剂盒检测移植瘤小鼠血清中CA Ⅸ、HIF-1α的表达水平。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 五组小鼠体重比较 治疗前，五组小鼠的体重相近，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 五组小鼠移植瘤体积的变化情况 从治疗后第10天开始，其他各组的肿瘤体积小于空白对照组(P<0.05)，紫杉醇组的肿瘤体积小于正常对照组(P<0.05)，紫杉醇中剂量和紫杉醇高剂量组的肿瘤体积小于紫杉醇低剂量组(P<0.05)，紫杉醇高剂量组的肿瘤体积小于紫杉醇中剂量组(P<0.05)。结果见图1、表2。

表1 五组小鼠体重的比较

图1 五组小鼠移植瘤体积的变化情况

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与正常对照组比较，#P<0.05；与紫杉醇低剂量组比较，@P<0.05；与紫杉醇中剂量组比较，&P<0.05

2.3 五组小鼠瘤重及抑瘤率的比较 持续治疗4周后，其他各组的瘤重低于空白对照组(P<0.05)，紫杉醇组的瘤重低于正常对照组(P<0.05)，紫杉醇中剂量组和紫杉醇高剂量组的瘤重低于紫杉醇低剂量组(P<0.05)，紫杉醇高剂量组的瘤重低于紫杉醇中剂量组(P<0.05)。

紫杉醇组的抑瘤率高于正常对照组，且随着紫杉醇剂量增加，对肿瘤生长的抑制明显增加。见表3。

2.4 五组小鼠肺癌组织中CA Ⅸ、HIF-1α表达情况比较 持续治疗4周后，五组小鼠肺癌组织中CA Ⅸ、HIF-1α表达情况如图2、图3所示，与空白对照组和正常对照组比较，紫杉醇低剂量组、紫杉

醇中剂量组和紫杉醇高剂量组小鼠肺癌组织中CA Ⅸ、HIF-1α表达水平明显降低。

2.5 ELISA检测五组小鼠血清中CA Ⅸ、HIF-1α表达情况 持续治疗4周后，其他各组小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α的表达水平显著低于空白对照组(P<0.05)；紫杉醇治疗组小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α的表达水平显著低于正常对照组(P<0.05)；紫杉醇中剂量组和紫杉醇高剂量组小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α表达水平显著低于紫杉醇低剂量组(P<0.05)，紫杉醇高剂量组小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α表达水平显著高于紫杉醇中剂量组(P<0.05)。见表4。

3 讨论

恩度是一种血管内皮抑制素，能通过抑制肿瘤新生血管的生成达到抑制肿瘤的目的，虽然恩度在大多数癌症的治疗中取得了一定效果，但其可导致相关毒副作用，如心血管毒性、肌肉关节疼痛、胃肠反应、肝脏毒性及皮肤过敏反应等。从临床用药情况来看，植物抗癌药物已普遍应用于癌症治疗中，其中应用最广泛的植物抗癌药物是天然植物碱[4]。

紫杉醇(Paclitaxel，商品名：Taxol)是从红豆杉属植物中提取的一种天然的植物碱，其有效成分是紫杉烷类二萜化合物，是近年来备受关注的抗癌药物之一。紫杉醇在低浓度下(0.25 μm)即催化微管蛋白的迅速合成，这些微管使细胞分裂停止于有丝分裂期的G2和M期，阻断了细胞的正常分裂，进而导致细胞凋亡[5-6]。紫杉醇在临床癌症治疗上取得了显著效果，申维喜等[7]研究表明，体外环境下紫杉醇可诱导Her-2过表达乳腺癌细胞凋亡，且呈剂量依赖关系。娄源杰等[8-9]采用恩度联合紫杉醇治疗非小细胞肺癌，结果表明，恩度联合紫杉醇能有效抑制肿瘤的生长、疗效较好；周风举等[10]研究表明，紫杉醇联合氟尿嘧啶类化疗药对腹膜转移胃癌有显著疗效；林锦源等[11]研究表明，紫杉醇单药治疗胃癌的有效率约为20%。本研究结果表明，紫杉醇组的肿瘤体积显著小于空白对照组和正常对照组，且呈剂量依赖型；持续治疗4周后，紫杉醇组的瘤重显著小于空白对照组和正常对照组，紫杉醇组的抑瘤率明显高于空白对照组和正常对照组，且随着紫杉醇剂量增加，抑瘤率明显升高。结果表明，紫杉醇能有效抑制肿瘤细胞生长。

表2 五组小鼠移植瘤体积的变化情况(mm3)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与正常对照组比较，#P<0.05；与紫杉醇低剂量组比较，@P<0.05；与紫杉醇中剂量组比较，&P<0.05

表3 五组小鼠瘤重、抑瘤率比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与正常对照组比较，#P<0.05；与紫杉醇低剂量组比较，@P<0.05；与紫杉醇中剂量组比较，&P<0.05

表4 五组小鼠血清中CA Ⅸ、HIF-1α 的表达水平(pg/ml)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与正常对照组比较，#P<0.05；与紫杉醇低剂量组比较，@P<0.05；与紫杉醇中剂量组比较，&P<0.05

图2 五组小鼠肺癌组织中CA Ⅸ的表达情况(400×)

图3 五组小鼠肺癌组织中HIF-1α的表达情况(200×)

HIF-1α最先由Semenza等[12]发现，与肿瘤生长、转移及患者存活有关[13-14]。研究表明，HIF-1α能够调控一系列基因表达介导组织细胞对缺氧的适应性，从而维持肿瘤细胞的能量代谢、新生血管生成，促进增殖及转移，同时增强肿瘤细胞对药物的耐受性[15]。目前，研究者已在多种恶性肿瘤中检测到HIF-1α蛋白的过度表达，如卵巢癌[15]、肾细胞癌[16]、前列腺癌[17]等。CA Ⅸ位于VLH肿瘤抑制基因的下游，由HIF-1α途径激活[17]，在正常人体组织中表达较低，但在许多肿瘤如肾细胞癌[16]、前列腺癌[17]和肺癌中表达明显增强，与肿瘤的发生密切相关[18]。

本研究结果表明，紫杉醇组小鼠组织和血清中CA Ⅸ和HIF-1α的表达水平显著低于对照组；且随着紫杉醇剂量增加，CA Ⅸ和HIF-1α的表达水平显著降低。结果表明，紫杉醇能够有效降低肿瘤细胞中CA Ⅸ和HIF-1α 的表达水平，推测紫杉醇是通过抑制肿瘤细胞生长来调控CA Ⅸ和HIF-1α 表达。

综上所述，恩度联合紫杉醇治疗C57BL/6小鼠肺癌能显著控制肿瘤的生长，降低CA Ⅸ和HIF-1α的表达水平，为肺癌的临床治疗提供一定的参考依据。

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