七叶皂苷钠通过上调SOCS-1表达抑制脑内出血诱发的炎症反应

范永会，王星利，张永丽，柴艺文

0 引言

脑出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)指非外伤造成的脑实质内出血，属于急性脑血管疾病的危重症，具有较高的发病率和致残率，对人类生命健康造成严重危害[1]。脑内出血发病机制极其复杂，至今尚未完全阐明，且无特异性治疗药物[2]。近年研究表明，脑出血后伴发脑水肿是造成患者死亡率高的主要原因，而脑水肿的形成与炎症反应具有密切联系[3]。细胞因子信号传导抑制因子1(Suppressors of cytokine signaling-1,SOCS-1)是由细胞产生的细胞信号传导负性调节蛋白，最新研究发现，其是先天性免疫及获得性免疫的关键调节因子，参与自身免疫疾病、炎症疾病等多种疾病的发生发展[4]。七叶皂苷钠具有消炎、消肿胀、恢复血管通透性等药理活性，临床研究表明，其在脑出血治疗中亦具有明显效果[5]。因此，本研究通过七叶皂苷钠给药，观察其对脑出血大鼠血肿周围脑组织SOCS-1的表达及相关炎症因子的影响，以期阐明其治疗脑出血的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 取2月龄雄性SD大鼠40只，SPF级，体重(280±20)g，购自河南省动物实验中心，合格证号：SCXK(豫) 2013-0001。

1.2 实验药物与试剂 七叶皂苷钠注射液：购自武汉普生制药有限公司，规格：5 mg/支，批号：国药准字H20057826。TNF-α、IL-1β、IL-6双抗体夹心法酶联免疫实验(ELISA)检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；TRIZOL购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒和SYBR®Premix Ex Taq®荧光定量检测试剂盒，购自日本Takara公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；RIPA蛋白裂解液和BCA试剂盒购自北京康为世纪生物技术有限公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；兔抗鼠SOCS-1、NF-κB抗体、羊抗兔IgG二抗，购自美国Abcam公司；ECL化学发光显色试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 实验仪器 鼠脑定位仪，购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；分析天平，购自德国Sartorius公司；冷冻离心机，购自美国Beckman公司；全波长酶标仪，购自美国Thermo公司；Mastercycler PCR仪，购自德国Eppendorf公司；7500型荧光定量PCR仪，购自美国ABI公司；电泳仪、转膜仪，购自北京六一仪器公司；全自动凝胶成像分析系统，购自美国Bio-Rad公司。

1.4 动物分组及造模 将48只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、七叶皂苷钠(低、中、高剂量)组，共5组，每组8只。参照Rosenberg等[5]自体血注射法建立模型。10%水合氯醛以350 mg/kg腹腔注射，固定大鼠于立体定位仪，颅顶消毒，正中线切开皮肤约1.5 cm，暴露前囟。自体血采集：置大鼠尾端于温水7 min，酒精消毒，于尾端2 mm外断尾采集血液。参照大鼠脑立体定位图谱定位，前囟前0.2 mm、矢状缝右侧3.5 mm、深度5 mm处，微量注射器缓慢注射50 μl新鲜自体血液，6 min注完，留针5 min再缓慢拔出，骨蜡封闭，缝合头皮。假手术组仅在同一时间点插入微量注射器，注射相同体积的生理盐水。

1.5 给药 术后，将大鼠置于安静、温暖饲养环境中，各组大鼠于造模后6 h开始给药。给药方法：七叶皂苷钠低剂量组、中剂量组、高剂量组分别腹腔注射2.5、5.0、10.0 mg/(kg·d)的七叶皂苷钠(溶于2 ml生理盐水中)；假手术组及模型组给予同体积生理盐水腹腔注射；高剂量联合SOCS-1腺病毒干预组在造模后6 h腹腔注射10.0 mg/(kg·d)七叶皂苷钠的基础上，采用微量注射器向右侧脑室注入含有SOCS-1基因的腺病毒10 μl，注射后留针5 min再缓慢拔出，骨蜡封闭，缝合头皮，每天1次，给药5 d。

1.6 观察指标 ①神经功能行为学评分[6]：采用Longa评分法对大鼠麻醉苏醒后6 h、1 d、3 d、5 d进行神经行为评分。0分：无神经功能缺损症状；1分：大鼠倒悬时，前肢呈屈曲状态，不能伸展前爪；2分：行走困难，有侧旋转征象；3分：行走困难并向病灶对侧倾倒；4分：意识下降，难以行走。②脑组织含水量测量：给药5 d后，将各组大鼠断头处死，采集大鼠脑组织称重即为湿重，置于80 ℃烘箱中24 h烘干后称重即为干重，组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。③ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平：给药5 d后，腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)进行麻醉后，在近心端抽取股静脉血2 ml，室温静置10 min，3 000 r/min离心10 min，取上清进行分装后存放于-80 ℃冰箱中；采用ELISA法检测各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。④RT-PCR法检测脑组织SOCS-1、NF-κB mRNA水平：大鼠麻醉取血后，断头取脑，并迅速剪取出血灶周围脑组织，称重后，迅速加入液氮进行研磨，采用Trizol法提取总RNA，采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，采用RT-PCR法检测脑组织SOCS-1、NF-κB mRNA表达量。最终结果以β-actin作为内参，采用2ΔΔCt法计算SOCS-1、NF-κB mRNA相对表达量，每组重复3次。引物序列见表1。⑤Western blot法检测脑组织SOCS-1、NF-κB蛋白水平：样本采集方法同上，称重后剪碎，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解，提取总蛋白。采用BCA检测试剂盒检测蛋白浓度，调整浓度一致后，上样20 μl通过10%SDS-PAGE分离胶分离蛋白，采用电转法将蛋白转至PVDF膜上，5%的脱脂乳室温封闭1 h，吸弃封闭液，加入预先稀释好的一抗，4 ℃孵育过夜，采用TBST洗涤膜，5 min×3次，加入羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h，TBST洗涤膜，5 min×3次，进行ECL显色，采用全自动凝胶成像系统采集图片，并通过Image-J软件进行条带灰度分析，最终结果以目的蛋白与内参蛋白β-actin的光密度比值表示目的蛋白的相对表达水平。

表1 基因的引物序列及产物大小

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能行为学评分比较 造模6 h后，假手术组大鼠未见明显神经行为变化，其他各组大鼠均出现神经缺损症状，说明造模成功；造模1 d后各组大鼠神经缺损最为严重，3、5 d时逐渐减轻，七叶皂苷钠低、中、高剂量组大鼠在造模后1、3、5 d神经行为评分均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，且具有剂量依赖性。见表2。

2.2 各组大鼠脑组织含水量比较 给药5 d后，假手术组、模型组及七叶皂苷钠低、中、高剂量组大鼠脑组织含水量分别为78.23±0.52、81.36±0.69、80.72±0.57、80.03±0.48、79.26±0.51，组间比较差异有统计学意义(F=38.526，P<0.05)；与假手术组比较，模型组大鼠脑组织含水量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，七叶皂苷钠低、中、高剂量组脑组织含水量均明显降低，且呈一定剂量依赖性，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 七叶皂苷钠对脑出血大鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，七叶皂苷钠低、中、高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显降低，且呈一定剂量依赖性，组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4 七叶皂苷钠对脑出血大鼠脑组织SOCS-1、NF-κB mRNA表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织SOCS-1和NF-κB mRNA水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，七叶皂苷钠低、中、高剂量组大鼠脑组织SOCS-1 mRNA水平明显升高，NF-κB mRNA水平明显下降，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，且均呈一定剂量依赖性。见图1。

表2 各组大鼠神经功能行为评分比较(分)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较(ng/ml)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

图1 各组大鼠脑组织SOCS-1、NF-κB mRNA表达水平

2.5 七叶皂苷钠对脑出血大鼠SOCS-1、NF-κB蛋白表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织SOCS-1、NF-κB蛋白表达量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，七叶皂苷钠低、中、高剂量组大鼠脑组织SOCS-1蛋白表达量明显升高，NF-κB蛋白表达量明显降低，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，且均呈一定剂量依赖性。见图2。

图2 各组大鼠脑组织SOCS-1、NF-κB 蛋白表达水平

2.6 SOCS-1、NF-κB蛋白表达水平相关分析 经Pearson相关性分析，结果显示，脑出血大鼠脑组织SOCS-1和NF-κB的蛋白表达水平呈负相关(r=-0.704，P<0.05)。见图3。

3 讨论

近年来，流行病学调查结果显示，脑出血的发病年龄逐渐趋于年轻化，且由于脑出血后多继发脑组织病理改变，甚至造成脑细胞不可逆损伤，导致其致残率较高，对患者及家庭均造成较大负担[7]。脑出血后脑水肿多伴有严重的炎症反应，该炎症反应是由白细胞、巨噬细胞、红细胞、补体等参与的炎性介质释放、炎性细胞迁移、脑组织破坏等过程，脑出血后炎症细胞聚集于病灶，释放炎性介质，参与脑出血的病理生理过程[8]。研究表明，脑出血后炎症因子的上调主要以TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等为主，TNF-α为促炎性细胞因子，可参与影响血管舒缩、导致炎性细胞自血管至神经组织发生迁移，从而参与调节血肿周围组织缺血性过程[9]；IL-1β亦为促炎性细胞因子，有研究显示，其表达上调可破坏血脑屏障，导致出血后损伤加剧[10]；IL-6主要通过调节中性粒细胞来调节脑损伤过程。本研究采用自体血注射法建立模型，结果显示，造模完成后大鼠均表现出不同程度的神经功能损伤，说明造模成功，进而对血清炎症因子进行观察，结果显示，脑出血大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高，表明脑出血所诱发的炎症反应在脑细胞损伤及疾病进展中可能发挥重要作用。

图3 脑出血大鼠脑组织SOCS-1和NF-κB蛋白表达水平分布图

七叶皂苷钠属于三萜皂苷钠盐，由婆罗子干燥成熟果实提取获得，可通过抑制毛细血管通透性减轻水肿，同时还广泛参与抗炎、抗肿瘤、改善血液循环、抗渗出等过程。Zhang等[11]在针对糖尿病大鼠创面愈合研究中发现，七叶皂苷钠可通过抗炎和抗氧化作用有效控制和改善糖尿病大鼠的创面愈合；杨宁等[12]研究表明，七叶皂苷钠能够明显抑制高血压脑出血患者的炎症反应，改善脑水肿。本研究给予脑出血大鼠腹腔连续5 d给药后，同样观察到大鼠神经功能有所改善，血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6均明显降低，与已报道观点一致，且呈现明显剂量依赖效应，说明七叶皂苷钠对脑出血诱发的炎症反应具有抑制作用。

NF-κB是广泛存在于真核细胞中的核转录因子，在机体炎症反应、细胞凋亡等基因转录调控中起核心作用，研究表明其能够作用于炎症机制、趋化因子、TNF-α、黏附分子等基因，进而调控其转录翻译[13]。近年来大量证据表明NF-κB与脑出血后继发脑损伤具有密切联系，其能够促进IL-1β、IL-6等炎症因子表达，进而加剧炎症反应，加重脑水肿[14]。

SOCS-1是细胞因子信号传导的负调控因子，能够反馈阻断细胞信号传导，在白血病、银屑病、恶性肿瘤等多种疾病中发挥重要作用，多项研究发现其能够在某种程度上阻滞疾病进展，因此被认为是疾病靶向治疗的候选基因[15-16]。最新研究发现，在脑出血大鼠模型中miR-155能够通过下调SOCS-1的表达，促进特异信号转导，增加TNF-α、IL-1β的转录，在脑出血诱导的炎症中发挥重要作用[17]。Smith等[18]研究指出，SOCS-1不仅是JAK-STAT信号通路的负反馈调节因子，亦是NF-κB、TLR等信号通路的负反馈调节因子。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠水肿灶周围脑组织的SOCS-1、NF-κB mRNA及蛋白水平均出现表达上调现象，可能由于脑出血后脑组织缺血性损伤导致NF-κB介导的炎症反应加重，而在机体免疫系统调控下SOCS-1同样出现升高，以发挥抑制作用，但SOCS-1含量虽有所增加，但与炎症因子释放量相比，其抑制活性仍处于较低水平，进而使机体免疫调控失衡，致使继发性脑损伤的发生。本研究显示，七叶皂苷钠能够明显上调SOCS-1的表达，且随着SOCS-1表达的增加，NF-κB表达出现明显下降，两者在脑组织中的表达呈明显负相关，与Smith等[18]的观点一致。

综上所述，七叶皂苷钠能够显著减轻脑出血后脑水肿，改善脑神经功能，其作用机制可能与上调SOCS-1的表达，进而抑制NF-κB及其相关炎症TNF-α、IL-1β、IL-6的表达有关，本研究为临床脑出血的防治提供了新的参考思路。

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