罗红霉素抑制COPD大鼠炎性介质释放对糖皮质激素抵抗的影响

张 松,黄 茂

0 引言

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种以呼吸道气流受限为主要特征的肺部疾病，其病死率及死亡率均较高，且呈逐年上升趋势[1-2]。COPD本质上属于气道慢性炎症性疾病，故治疗以抗炎为主。糖皮质激素抗炎作用强大，在COPD治疗中有着广泛应用。然而，临床观察显示，部分患者即便采取大剂量糖皮质激素治疗，效果也极不明显，提示患者体内可能存在某种机制，引起机体对糖皮质激素的敏感性降低，即为糖皮质激素抵抗[3-5]。糖皮质激素与糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor，GR)结合后方发挥抗炎作用，近年研究发现，GRα型受体是糖皮质激素发挥效应的主要受体，而GRβ型受体则是内源性糖皮质激素效应的拮抗因子，激素抵抗型哮喘患者GRα表达下调、GRβ上调，因此，推测 GRα/GRβ失衡是造成COPD患者糖皮质激素抵抗的重要原因[6-7]。罗红霉素是新一代的大环内酯类抗生素，临床公认其在COPD治疗中可发挥良好的抗炎作用，然而关于其是否能够逆转糖皮质激素抵抗，国内尚未见相关报道[8]。本研究旨在探讨罗红霉素抑制COPD大鼠炎性介质释放对糖皮质激素抵抗的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性裸大鼠40只，体重18～22 g，月龄4～6个月，由北京维通利华实验动物有限责任公司提供，动物编号：SCXK(沪)2015-0002；饲养于我院动物中心实验室SPF环境中，温度(24±2)℃，湿度30%～60%，常规自由饮食，每天日照12 h，通风良好。实验时对实验动物的处理方式符合动物伦理要求。

1.2 药物与试剂 罗红霉素(江苏云阳集团药业有限公司)，ELISA检测试剂盒(武汉转导生物实验室)，兔抗大鼠GRα多克隆抗体、GRβ多克隆抗体(北京维亚生物技术有限公司)，RT-PCR试剂盒[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]，GRα、GRβ引物(北京博大泰克公司)，通用型SP免疫组化试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)，DAB显色试剂盒(上海威奥生物科技有限公司)，苏木精(美国Sigma-Aldrich公司)，伊红(上海抚生生物科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 试验分组 饲养1周后，选取30只环境适应良好的大鼠，对大鼠进行编号，并采用随机数字表法分为3组，即空白组、模型组、罗红霉素组，每组10只。

1.3.2 建立模型 模型组与罗红霉素组：分别于第1、31、61天由气管灌注0.2 ml 1.0 g/L的脂多糖溶液，并于2～30 d、32～60 d、62～90 d等3个时间段内将大鼠置于60 L玻璃熏咽箱中被动吸烟，6 h/d。空白组：不予以建模(以0.2 ml生理盐水与新鲜空气处理)。

1.3.3 干预 模型组：由第91天起予以生理盐水灌胃，2 ml/次，1次/d，连续30 d。罗红霉素组：由第91天起予以罗红霉素灌胃，剂量为30 mg/kg，1次/d，连续30 d。空白组正常饲养，不予处理。30 d后，行大鼠解剖处理，采集大鼠腹主动脉血2 ml，静置、离心取血清；分离大鼠右肺前叶，留取肺组织。

1.3.4 炎症因子检测 采用ELISA试剂盒检测血清白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平，严格按照ELISA试剂盒进行操作。

1.3.5 肺组织观察 取适量肺组织，经固定、包埋、切片等处理，并予以HE染色后，采用光学显微镜观察大鼠肺组织病理形态学变化。

1.3.6 肺组织GRα、GRβ mRNA表达水平测定 采用RT-PCR法进行检测。取肺组织，适当研磨，提取RNA，反转录为cDNA。GRα上游引物、下游引物分别为5′-TCCAAAGCCGTTTCACTG-3′、5′-CAAGAGGTCAAAGGTGCT-3′；GRβ上游引物、下游引物分别为5′-TGGTTTCCTGTTCGCTCT-3′、5′-TGGTTTCCTGTTCGCTCT-3′；GAPDH上游引物、下游引物分别为5′-GTTCAACGGCACAGTCAA-3′、5′-CAGATCCACAA

CGGATACA-3′；GRα、GRβ、GAPDH扩增片段为348、266、571 bp。PCR扩增：取反转录产物2 ml，上游引物1 μl，下游引物1 μl，10×Easy Tag Buffer(含Mg2+)5 μl，dNTPs 4 μl，Easy Tag DNA Polymerase 0.5 μl，加ddH2O至50 μl。扩增完成后行琼脂糖凝胶电泳，经EB染色，紫外线投射仪下对电泳条带进行观察。GRα、GRβ mRNA表达水平以目的条带与GAPDH灰度值之比进行描述。

1.3.7 肺组织GRα、GRβ蛋白表达水平测定 取肺组织，加入组织蛋白裂解液，裂解后采集上清液，采用Brad-ford法进行测定。取蛋白样品，依次行制胶、上样、电泳分离、脱水等处理。分别加兔抗大鼠GRα多克隆抗体、GRβ多克隆抗体、二抗进行孵育，三种抗体稀释比例分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶4 000。ECL发光，经凝胶成像仪进行成像，直至胶片透明，扫描后，采用Bandscan5.0软件分析灰度。

2 结果

2.1 三组肺组织病理形态学特征 空白组：支气管黏膜上皮细胞完整，无明显炎性细胞浸润，肺泡结构连续、紧凑，肺泡壁完整，肺泡腔正常、未见扩大，且无明显炎性细胞渗出(图1A)。模型组：支气管黏膜上皮细胞有明显脱落，管壁存在大量炎性细胞浸润，肺泡壁显著变薄，肺泡明显扩张，管腔聚集有大量炎性渗出物(图1B)。罗红霉素组：支气管黏膜上皮细胞有少许脱落，管壁有少量炎性细胞浸润，肺泡轻度扩张，管腔内存在少量炎性渗出物(图1C)。

2.2 组间血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平比较 与空白组比较，模型组血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平明显增高(P<0.05)；与模型组比较，罗红霉素组血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平明显降低(P<0.05)。见表1。

2.3 组间肺组织GRα、GRβ mRNA及蛋白水平比较 与空白组比较，模型组肺组织GRα mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05)，GRβ mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05)。与模型组比较，罗红霉素组GRα mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05)，GRβ mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05)。见表2。

3 讨论

COPD为一种以气流受限为特征的慢性呼吸系统疾病，发病率及死亡率均较高，严重威胁人类健康[9]。被动吸烟是建立COPD模型的常用方法[10]，维持30周以上的被动吸烟便可实现COPD模型成功建立，但为减少实验等待时间，节省实验费用，目前常在被动吸烟基础上联用其他方法进行建模[11-12]。本研究采用被动吸烟联合气管灌注脂多糖的方式进行COPD大鼠模型的建立，结果显示，以空白组为对照，模型组支气管黏膜上皮细胞有明显脱落，管壁存在大量炎性细胞浸润，肺泡壁显著变薄，肺泡明显扩张，管腔聚集有大量炎性渗出物，且模型组大鼠肺组织病理形态学特征与人类COPD的病理形态学改变相符，提示建模成功。呼吸道慢性炎症是COPD发生的核心机制[13]。IL-8是细胞趋化因子家族的重要成员，在中性粒细胞、T淋巴细胞聚集和活化中发挥着重要作用；TNF-α是重要促炎因子，可刺激巨噬细胞等多种细胞释放大量炎性因子；MCP-1参与巨噬细胞的聚集和活化，增加炎性细胞浸润。上述3种炎性介质均被证实参与了COPD的发生发展，与患者预后密切相关[14-16]。本研究中，与空白组比较，模型组血清TNF-α表达明显增高，肺组织GRα mRNA及蛋白表达降低，肺组织GRβmRNA及蛋白表达明显降低，验证了GRα/GRβ失衡是COPD发生的重要机制。

图1 三组大鼠肺组织HE染色(400×)

组别只数IL-8TNF-αMCP-1空白组10153.54±18.69139.12±18.24113.47±16.72模型组10258.98±27.43*244.69±35.61*244.56±29.41*罗红霉素组10196.84±21.54#182.36±27.13#152.46±23.26#

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表2 组间肺组织GRα、GRβ mRNA及蛋白水平比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

糖皮质激素是治疗COPD最有效的抗炎药物，但对部分患者疗效较差。研究认为，吸烟哮喘患者存在显著的糖皮质激素抵抗，其治疗药物选择是临床面临的棘手问题[17]。大环内酯类抗生素除可发挥抗感染作用外，还具有良好的抗炎作用，因此，该类抗生素在多种炎症性疾病的治疗上有着广泛应用[18-19]。研究表明，长期应用罗红霉素可改善COPD患者的临床症状，改善患者生活质量[20]。另有研究显示，罗红霉素治疗急性加重期COPD，能够明显降低患者血清IL-8、TNF-α等炎性介质表达水平[21]。本研究结果显示，与模型组比较，罗红霉素组血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平明显降低，证实了罗红霉素的抗炎作用。本研究还显示，与模型组比较，罗红霉素组GRα mRNA及蛋白表达明显升高，GRβ mRNA及蛋白表达明显降低，表明罗红霉素对糖皮质激素抵抗有改善作用。

综上所述，罗红霉素能够抑制IL-8、TNF-α、MCP-1等炎性介质释放，调节GRα/GRβ平衡，对逆转COPD大鼠糖皮质激素抵抗有积极作用，值得深入研究。

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